第六章-抗体工程制药.pptVIP

将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。 Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特异性抗体。 所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。 分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。 化学交联BsAb 细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。 基因工程BsAb 从广义讲应属于双功能抗体范畴。 （1）配基—配基型融合蛋白，如 CD4-Fcγ. （2）配基—Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受体—FV型融合蛋白 （5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶） 四、抗体融合蛋白 第四节 噬菌体抗体工程 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 （一）基本原理和程序 噬菌体抗体库 （二）噬菌体表面展示文库技术的要点 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， （三）噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。 3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它