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DNA多态性及其分析技术 第一节 多态性概述 一. 定义 不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物的多态性（polymorphism）。 生物群体中个体间的变异有的是由环境因素，如营养、气候等造成的；有的则是由遗传因素造成的。由遗传因素造成的变异形成一系列的多态性，称为遗传多态性（genetic polymorphism ）。 二.标准 发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。在某些时候，一个基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性（dimorphism）。 三.分类 遗传多态性主要可分为遗传表型的多态性和DNA的多态性两大类。 由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型。 检测遗传表型多态性有其局限性： ①遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分变异。后者只占人基因组总DNA的10%（＜10%）。基因及基因相关序列占总DNA的25%。 ② DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变。这时检测表型就不能发现编码基因中存在的变异。 ③基因的表达会有变异，基因型完全相同的生物体在不同的生长条件下可能有不同的表型，靠检测表型多态性来推断基因有时会出现错误结论。 分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的多态性。 人类基因组序列概况 第二节 DNA多态性的分类 DNA是遗传信息的物质基础，因而是反映个体间差异的最本质东西。DNA序列组成的个体特异性主要表现为下列类型的DNA多态性。 一.基因多态性 由于控制性状的基因碱基组成上的不同造成的多态性。 采用等位基因特异性探针（ASO或SSO探针）或限制酶切消化进行分析。 如人类白细胞抗原（HLA）系统，编码HLA-DR抗原的位点有超过200个等位基因。 二.重复序列多态性 串联重复序列多态性（variable numbers of tandom repeats,VNTR）： ①相同的核心序列，不同的个体重复的次数不同。 ②不同的重复序列，其核心序列的组成会不同。 ③在核心序列之间，不同的个体间会存在有无插入小段DNA或插入的片段长短不同的差异。 因此，两个无关个体的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度，这是DNA指纹形成的基础。 中度重复的散在重复序列多态性。 遍布哺乳动物基因组中 三.性染色体多态性 X染色体的重复序列多态性 Y染色体的特异性片段多态性。 四.线粒体的DNA多态性 人线粒体DNA的D环 两个无关个体间，完全相同的可能性只有0.27%。 第三节 DNA多态性分析技术 一.RFLP分析技术 基本原理 限制性酶切片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）：用某种特定的限制性内切酶消化不同的DNA片段，由于DNA的碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段。这样采用合适的限制性内切酶消化待分析的DNA片段，就能根据切出来的片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交，显出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。这一技术的基础是通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同。 RFLP技术的基本步骤 一.靶DNA的准备 先将人基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离，使其按片段的长短排列，将DNA片段变性后转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上（称为印迹转移，即Southern blot），并固定在这些载体上面。 二.核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化，用同位素（如32P）或非同位素标记，经纯化后使用。 三.杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链DNA杂交，洗膜以后进行放射自显影或加入酶的反应底物显色，再对显示出来的谱带进行分析。 影响RFLP的几个因素 一.限制性内切酶 影响RFLP图谱的重要因素。 市售常见的有100多种。 星号*活性即非特异性酶解活性。反应液中甘油、乙醇浓度及被酶解DNA的质量和浓度。 二.核酸探针 不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。 1.基因探针 人基因组中某一基因的一个片段。 常用于研究人类遗传性疾病。 影响RFLP的几个因素 2.随机探针 从人基因组DNA中随意挑选出一个DNA片段，其功能并不知道。 采用统一的命名法：D后为来源之染色体的号码，S为单拷贝（NF代表有多个片段），最后是分配给定的序号。如D14S1等。 可进行疾病基因连锁分析。 3.重复序列探针 基因组中的重复