以ITC技术导航激酶抑制剂抑制机理研究技术.PDF

题 专 用 应 子 分 小 应用指南 以ITC技术导航激酶抑制剂的抑制机理研究技术 Geoff Holdgate 引言 ITC实验通常包括在恒温条件下针对目标蛋白滴定测试化 合物，利用ITC仪器测量结合期间所释放或吸收的热量。 表征人源激酶组的研究以及现有的激酶晶体结构在过去 几年中的激增已经引起人们日益关注以激酶作为潜在药 ITC可以在以蛋白激酶为重点的药物发现中以多种方式进 靶用于许多治疗领域中的药物干预。 行使用。这些包括蛋白质结构的表征和制备（不仅是对 于模型配体的正确亲和力方面，而且是对于正确的化学 自20世纪80年代后期，制药行业开始对针对ATP位点的 计量方面，也可以估计功能蛋白的量，无需催化活性）； 激酶感兴趣，大多数激酶抑制剂被开发出来。然而， Gleevec™药物的开发，它引起的结构重排导致AbI激酶 检测法评估；提供生物学活性的分子间复合物的鉴定 采用失活的构象，这为制药行业重新注入了活力，并为 （ITC能够提供关于另一种化合物的存在是否影响测试 处理激酶抑制产生创新的观点：包括在ATP位点之外的 化合物活性的信息）。这正是本应用指南将关注的ITC 结合以及尝试阻止激酶激活。 的应用。 为了根据新的观点表征化合物的作用机制，需要经常进 目标蛋白质量控制 行详细的酶动力学研究。而ITC技术不仅提供了一种化合 尽管不是必要的，但在进行机制研究前进行目标蛋白的 物与目标蛋白结合的完整的热力学属性，海可以对化合 质量控制研究是有用的。这应该采用验证蛋白质的特性、 物结合不同的酶形式的亲和力测量值进行比较，例如游 纯度、浓度、功能和稳定性的形式。 离酶、酶-底物复合物、酶-产物复合物、激活或失活的 酶等。 微量热法可以被应用于这些重要领域中的两个方面。通 过比较一种已知配体的滴定所获得的亲和力和化学剂量 蛋白激酶作为治疗目标 关系与一系列目标蛋白的文献报道值，ITC已经被用于验 在过去的几年中随着临床验证的激酶抑制剂的出现，蛋 证测试蛋白的功能。差示扫描量热法（DSC）是一种相 白激酶抑制剂的地位已经有些改变。因此，对于激酶信 关微量热技术，已经被用于验证蛋白质具有明显高于实 号通路的抑制在肿瘤和炎症领域中是用于疾病治疗的公 验温度的熔融温度Tm 。通常，孤立的激酶结构域只能够 认治疗方法。 部分稳定，具有的Tm值大约在40℃，（图1）。在着手 进行详细的机制研究前应用诸如此类的技术表征目标蛋 目前有超过250种激酶可用于测试，因此抑制剂作用方 白从长远来看可以节省时间和成本，有助于避免由于较 式的快速表征是十分必要的。 差的蛋白质质量所导致的假的或误导的结果。激酶结构