copd发病方法机制与主要研究方法 ppt课件知识讲稿.ppt

琼脂糖凝胶的优点.缺点 优点: (1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 缺点： 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少 DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理 DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 操作步骤 1. 准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子 2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶 具体步骤： 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5×TBE) 煮胶溶解 冷却至60℃(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1~2nm。 3. 加样 将DNA样品（5ul）与6 ×上样缓冲液（1ul） 混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。 每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。 4. 电泳 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳 5. 结果观察 电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。 1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形； 2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔； 3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶； 4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔； 5 、紫外线照射不要太久。 6注意事项 小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察 1.提前3天小鼠腹腔注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基（已经灭毒的溶液） 2.巨噬细胞取出a：腹腔内注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基三天后，将小鼠以颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡15min，仰卧，固定四肢 b:在无菌台中打开小鼠腹部皮毛，操作要轻柔不要破坏腹膜，并用75%酒精局部消毒。C：用10ml注射器吸10mlPBS，从小鼠腹部下方进针，注入小鼠腹腔，并迅速拔出注射器，以免液体外流。D：冲洗小鼠腹腔，提起小鼠尾巴，不断旋转小鼠，让液体与小鼠的大网膜充分接触，以提取更多的细胞。e：轻柔的抽取腹腔内的溶液，f：将回收的小鼠细胞收集在15ml的离心管内，置于冰上，做好标记。 巨噬细胞培养 1.将收集的巨噬细胞离心，1000rcf离心10min 2.弃上清，往细胞沉淀中加入1ml的红细胞裂解液，不断吹打使其成悬浮液，冰上静置5min。 3.1000rcf离心10min，弃上清，加入10%DMEM培养基，反复吹打细胞悬浮。 4.使用细胞计数板在显微镜下计数细胞，并计算出总的细胞数。 5.将收集的细胞平均分配在6孔板中培养。 整个过程在无菌条件下操作。 血细胞形态 正常粒细胞系统形态？ 1、原始粒细胞：胞体直径10~18μm，圆形或类椭圆形。胞核较大，约占细胞的2/3以上，圆或类椭圆形，居中或略偏位，核染色质呈细砂粒状，均匀、平坦如一层薄砂，无浓集。核膜薄较模糊，染成淡红色。核仁2~5个，较小，清楚。胞质量少，染成淡蓝或深蓝似天蓝色，透明绕于核周，无颗粒。过氧化物酶染色阴性，但后期有时也可呈阳性反应。 2、早幼粒细胞：胞体直径12~20μm，较原粒细胞大，圆或椭圆形。胞核大，圆或类椭圆形，位于中央或偏位。核染色质呈粗粒状，较原粒粗，开始聚集。核仁可见或消失。胞质量较多，呈淡蓝、蓝或深蓝色，浆内含大小、形态和多少不一的紫红色非特异的天青胺蓝颗粒，分布不均。过氧化物酶染色阳性。 3、中幼粒细胞： （1、）中性中幼粒细胞：胞体直径10~