2015年-10-19--第三章—蛋白质研究技术-1.pptVIP

提纲 一、蛋白质的理化性质（略讲） 二、蛋白质的研究技术 三、蛋白质的分类（不讲） 原料是基础--膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 抗体的选择 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 八仙过海，各“显”神通--显色方法 同位素法 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短 ? 荧光底物法 Krypton ?荧光底物 Further Readings 生物秀Western Blotting专题 /special/experiment/WesternBlotting.htm Millipore的蛋白印迹手册 /thread-45770-1-1.html Bio-Rad的western Blotting操作手册 /thread-30154-1-1.html Western blot问题解答专帖 /thread-40769-1-1.html （一）、蛋白质测序策略 (2) 多肽链的拆分 （一）、蛋白质测序策略 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 （一）、蛋白质测序策略 (3) 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 （一）、蛋白质测序策略 (4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比 (5)分析多肽链的N-末端和C-末端 (6)多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。 （一）、蛋白质测序策略 (7)测定每个肽段的氨基酸顺序 (8)确定肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。 （一）、蛋白质测序策略 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。 蛋白质顺序测定的基本战略 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链（最适pH约2，此时二硫键不断开）（在二硫键保持完整的条件下，将蛋白质特异切割成肽段。） 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置 末端氨基酸残基的鉴定 Sanger反应 末端氨基酸残基的鉴定 二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 末端氨基酸残基的鉴定 肽链外切酶从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 末端氨基酸残基的鉴定 肼，又称联氨，无色、油状液体，主要用作火箭和喷气发动机的燃料。 多肽与无水肼加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成酰肼化物。酰肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 末端氨基酸残基的鉴定 肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量确定蛋白质C-末端残基顺序。 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制） R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro（抑制） pH8-9 R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2 2、化学裂解法 ①溴化氰水解法 ——选择性地切割