溶菌酶降解壳聚糖的实验研究.doc

溶菌酶降解壳聚糖的实验研究 第23卷第6期 2002年12月 大连大学 JOURNALOFDALIANUNl\/ERSlTY Vo1.23No.6 Dec.20o2 溶菌酶降解壳聚糖的实验研究 孙慎侠,范钦信,韩振武,吴恩海 (大连大学医学院,辽宁大连116622) 摘要:【目的】探讨溶菌酶对壳聚糖有水解活性并对水解后的产物进行初步分析.『方 法】在37℃条件下,将溶菌酶作用于壳聚糖,测定作用后溶液的粘度和还原糖量的变 化;用纸层析法分析溶菌酶作用壳聚糖后的产物.【结果】溶菌酶具有一定的水解壳聚糖 活性,且水解后壳聚糖的粘度随水解时间延长而下降,还原糖量随时间延长而增加,10h 后趋于平稳,水解产物的相对迁移率小于棉子糖.【结论】溶菌酶可以水解壳聚糖,水解 产物为大于三糖的多糖. 关键词:溶菌酶;壳聚糖;粘度;纸层析 中图分类号:Q946文献标识码:A文章编号:1008.2395(2002)06.0090.04 壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物,其化学结构是D.葡萄糖胺通过l,4糖苷键 结合而成的多糖,近年来被称为人体必需的第六生命要素[1】.而壳聚糖作为一种高分子的 碱性多糖,如将其降解为4～l0糖基的壳寡糖[2】,则具有多种药理活性,特别是具有抗肿 瘤活性,在医学领域有着重要的应用前景. 溶菌酶是一种广泛存在于人体内的水解多糖的酶,其作用部位是多糖的.1,4糖苷 键.作者旨在研究溶菌酶能否降解壳聚糖,并对降解后产物作初步探讨,为壳聚糖作为保健 产品的开发提供理论依据. 1材料与方法 1.1材料壳聚糖(由大连大学化工系提供),溶菌酶(上海三维长江生化制药厂提供). 1.2主要仪器7230分光光度计上海分析仪器厂;TG328A电子分析天平上海天平 仪器厂;521E)aB微量刻度吸管(0.2IIl1)天津玻璃厂. 1.3方法 l-3.1粘度测定:粘度的测定方法基本上按照参考文献[4]的方法进行,取l0支试管,每 支试管中加入相应的试剂,见表1. 表1溶茵酶作用壳聚糖粘度测定溶液配制表 试管编号123458__●—— 1.O 一 4.o 1omg/ml溶菌酶(Trd)1.o1.o1.o1.o1.o 灭活溶菌酶(ra)一一一一一 20,w,/ml壳聚糖(Trd)4.04.04.04.04.0 收稿日期:20o2-o7-l0 作者简介:孙慎侠(1969一),女,讲师,硕士 ～一一～一 一 第6期孙慎侠等:溶菌酶降解壳聚糖的实验研究91 完成操作后,将上述10支试管置于37℃水浴保温,每隔一定时间用微量吸管法测定 其粘度.微量吸管吸取0.2Ⅱll壳聚糖和溶菌酶混合液,在室温条件下,记录下降0.1Ⅱll所 需时间(),每份标本重复3次,求平均值.用蒸馏水(了1水)和壳聚糖溶液(丁壳)作为 对照,按公式计算相对粘度: 个一下 相对粘度(r7)= 1壳一1水 1.3.2还原糖测定:试剂的配制和还原糖的测定方法按照参考文献[3】的方法进行.壳聚 糖水解成壳寡糖后,产生较多的半缩醛羟基,使其还原性增加,将铜离子还原为亚铜离 子,亚铜离子再还原磷钼酸生成钼蓝.采用比色法测定还原糖量. 将10mg/rr~溶菌酶2.0ml加入20mg/ml壳聚糖溶液8.0ml,每隔一定时间取样,每份 标本重复2次.用蒸馏水作空白对照,=600n121进行比色,见表2. 表2溶菌酶作用壳聚糖后生成还原糖量测定溶液配制表 酶作用时间(h)00.511.52468101224 壳聚糖和溶菌酶混合物(1Tl1)O.20O.20O.20O.20O.20O.20O.20O.20O.20O.200.20 碱性铜试剂(rra)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 磷钼酸试剂(rra) 蒸馏水(rra) 煮沸10min 1.Ol_01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 3.03.O3.O3.O3.03.03.03.03.03.03.0 1.3_3纸层析法测定水解产物成分:分别称取葡萄糖,蔗糖,棉子糖各1.0g,溶于50Ⅱll蒸 馏水中配成2%的标准溶液.将1Ⅱll10mg/rra溶菌酶与9ml20mg/rr~壳聚糖溶液混匀, 作用10h后的产物作为待测样.纸层析法按照参考文献[3】进行,略加改进,测定溶菌酶 作用壳聚糖后的水解产物. 2结果 2.1粘度测定结果 溶菌酶作用壳聚糖不同时间对其溶液的影响,见表3.以时间为横坐标,粘度下降率 为纵坐标绘制趋势图,见图1. 表3溶菌酶作用壳聚糖对其溶液粘度的影响 酶作用时间(h)0O.5l1.52468l0l224 粘度()(溶菌酶)lO.64O.48O430.400.350.320.290.280.280.27 牯度(H)(失活溶菌酶1ll0.990.980,970.970,970,950,95