PCR技术理与操作.ppt

PCR技术原理与操作 主要内容 核酸的种类与功能 DNA复制原理 PCR发展简史 PCR基本原理 PCR体系各组分及作用 PCR操作步骤及分析 PCR技术的优缺点 3、微生物分类（按核酸类型） （1）DNA微生物： 细菌、寄生虫类（附红细胞体、弓形体）、衣原体、支原体 DNA病毒 疱疹病毒科:伪狂犬病毒、马立克病毒、传染性喉气管 炎病毒和鸭瘟病毒； 圆环病毒科：猪圆环病毒、鸡传染性贫血病毒； 细小病毒科: 猪细小病毒、犬细小病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒； 痘病毒科：鸡痘、山羊痘和绵羊痘； 腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒 （2）RNA微生物 RNA病毒 正粘病毒科：流感病毒 副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫 病毒 弹状病毒科：狂犬病病毒、牛流行热病毒 冠状病毒科：鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠 炎病毒、猪 流行性腹泻病毒、SARSV 黄病毒科：猪瘟、乙型脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒 小核糖核酸病毒科 ：口蹄疫病毒 披膜病毒科 ：猪繁殖与呼吸综合征病毒 双RNA病毒：传染性法氏囊病毒 反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒 二 DNA复制原理 半保留复制 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... 四 PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。 首先待扩增DNA模板加热变性解链， 随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火， 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 六 PCR操作步骤与结果分析 1、RNA/DNA提取 2、RNA的反转录 3、PCR扩增 4、电泳分析产物 1、RNA/DNA提取 （1）异硫氰酸胍法和Trizol提取法（RNA) （2）酚-氯仿提取法和DNAzol提取法（DNA) （3）柱子提取法 （4）全自动核酸提取法 (2)DNA提取 (2)DNA提取 样品DNA的抽提 自水浴锅中取出已处理的样品，加500μL 酚-氯仿-异戊醇(用之前不要晃动，不要吸到上层保护液)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。 酚-氯仿-异戊醇，使DNA从组织中游离到水相，与蛋白分开。 取约500μL上清置于灭菌离心管中，加入500μL 异丙醇，混匀，室温沉淀10-20min。 异丙醇主要沉淀DNA。 取出样品管，13 000 rpm离心15min。 弃上清，加入700μL 70%乙醇，轻弹管壁以使沉淀充分悬浮，12000 rpm离心5min，弃上清，将离心管倒扣于吸水纸上1min以吸干残液或10000rpm空离30sec后用移液器吸去残液（注意：滴头勿接触沉淀），再将离心管50℃烘干或真空抽干15min(以无乙醇味为准)。 乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。 取出样品管，用10-20μL 灭菌的去离子水溶解沉淀，作为模板DNA备用。 (3)RNA的反转录 cDNA的合成：取 RNA 10μL加入反转录反应体系中，37℃水浴1h后，直接用于下面的PCR反应或-20℃冻存备用。 (4)PCR扩增 取RNA反转录产物或提取的DNA（DNA直接进行扩增）2μL加入PCR反应体系中，总体系25μL。扩增条件为95℃ 5min后，94℃ 45sec，56℃ 45sec，72℃ 45sec共 35个循环，最后72℃延伸10min。 取TAE缓冲液50倍稀释后用于配制1.5％的琼脂糖凝胶及作电泳缓冲液用。取10μL PCR产物，混于2μL 6×上样缓冲液液中，电泳分析PCR产物。以DNA分子量Marker为片段长度大小参考。 七 PCR技术优点和缺点 优点： 直接针对病原进行诊断，诊断快速（3－6个小时内 可出结果，荧光2－3h） 特异性好（准确性高，一般不会误诊） 灵敏度高（最低可检出几个拷贝的病原量） 缺点： 实验室条件要求高。 操作人员技术要求高。 试剂成本较高。 谢谢大家！ (1)Trizol提取RNA法： 4℃条件下12 000 r/min离心30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量