PCR技原理与方法.ppt

基因组DNA 获取特定DNA片段 扩增特定DNA片段 1) 基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 大肠杆菌 胰岛素 重组体 + 胰岛素基因 基因工程产品 2)基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 六、PCR维护与保养 1.定期检测：半年至少1次 2.温度：反应温度、实际温度；降温时间。 2.样品池的清洗??? 3.热盖的清洗??? 4.仪器外表面的清洗????? 5. 使用注意事项：热盖、PCR管、样品台、电源、环境 主要内容 PCR概念 PCR原理 PCR技术参数 PCR操作步骤 PCR应用 PCR维护与保养 一、PCR概念 PCR又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。 二、PCR的原理 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA，4种脱氧核糖单核苷酸，耐热性多聚酶，一对合成DNA的引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍；扩增了特异区段的DNA带。 2000 1500 1000 700 400 200 1 2 3 4 1.反应体系 总体积 25~100 ?l DNA分子 模板 dNTP 原料 Primer 引物 Buffer 缓冲液 Taq酶 DNA聚合酶 2.循环参数 94℃ 30” 50~60 ℃ 30”~1’ 72 ℃ n’ 94~96℃ 30”~5’ 72℃ 3~7min 4~10℃ forever 25~30循环 模板DNA 95℃ 3.PCR原理动画 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 三、PCR技术参数（以本实验PCR仪为例） 杭州朗基科学仪器有限公司 型号：A200 序列号：001-60380 模块类型：9677 温度范围：0~99.9℃ 热盖温度：0~112℃ 最大升温（降温）速度：0.5℃/s 旋钮 热盖 触摸屏 通风口 USB-A口 手柄 开关 电源接口 通风口 USB-B口 网络接口 使用注意事项 热盖：热盖可以降低温度来压紧反应容器，并通过加热使反应容器上部保持在比样品更高的温度以防止反应样品冷凝。（43℃）。打开热盖： 关闭热盖： 样品台的更换： 开机与关机：（......）仪器长时间不用时拔掉电源插头。开机几秒后出现主界面。 五、PCR操作步骤（以本实验室PCR仪为例） 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 …… PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 五、PCR应用