LAMP引设计实例.pdfVIP

广州迪澳生物科技有限公司 推荐LAMP 最佳引物设计和分析流程： 1、 首选确定好需要检测的目的基因及序列（最好大于2kb ，这一步的目的是增加在最佳参数下 产生设计结果的可能） 2 、 将荣研第四版LAMP 引物设计软件设软件的各项参数均设为最佳参数 (1) 如果没有结果产生，则稍微调整或放宽CG 比 (2) 还没有结果产生，再适当放宽Tm 值 (3) 还没有结果产生，再适当调整或放宽引物间距 (4) 还没有结果产生，返回步骤(1)继续放宽CG 比，让后在放宽Tm ，按照上述步骤进 行循环。直至产生结果。（详见下页图表） 3、 导出设计结果 4 、标记出5-10 套最符合3’、5’的 ΔG 符合要求的引物(F1C 和B1C 引物的5’和其他引物的 3’尽可能的比-4 小)(这一步的目的是首先要控制反应能够特异的发生) 5、 在上述5-10 套引物中，选择荣研软件计算得出二聚体发生趋势最小的5 套 （或5 套以 内）引物(这一步的目的是在反应能够特异性发生的基础上控制引物自身扩增形成二聚体的可能) 6、 分析这5 对引物的Tm 值，选择尽可能接近要求(60 ℃和65 ℃) 的引物2-3 套 7 、 分析CG 比，选择尽可能接近要求(50-60%)的引物1-2 套(上述两步是在保证引物的特异性， 控制假阳性的基础上进一步对引物进行优化) 8、 对确定好的1-2 套引物用OLIGO 软件进行引物分析，最终确定1 套最佳引物 引物设计软件参数调整流程 广州迪澳生物科技有限公司 广东省广州市科学城科学大道 182 号 创新大厦C2-1303 电话：020邮编：510663 广州迪澳生物科技有限公司 6110 第一套引物总体评价  从设计结果来看，引物3’和5’ ΔG 是比较容易满足的  由于CG 比例和目的序列有关，但可以通过输入较长的目的片段(1Kb) ，而相对容易满 足  该套引物的Tm 值是根据PCR 引物设计原则（不同引物之间Tm 值最好能够接近）为标 准从设计结果中选择的，所以和最佳Tm 存在一定偏差，但是可以在设计结果选择中加 以改善。  引物二聚体和发夹结构是比较难避免的，需要通过引物设计软件primer 5 和oligo 进行 两两匹配分析，由于需要针对3 对，一共6 条引物之间和引物本身进行错配分析，一套 引物共需要进行21 次分析，所以较为耗时，而且比较难以选择最佳结果。 详细分析结果： 1. Tm 值：(最佳：F1C 和B1C 为65 ℃；其余为60 ℃ ) F1c 和 B1c 的Tm 为63 ～64 ℃比最佳要求低 其余Tm 均符合最佳要求 2. CG 比(最佳：50~60%) F2(50)符合最佳要求 F3(61)符合要求 FIc(63); B2(65); B1c(63); B3(65)不太符合最佳要求 3. 二聚体 有五对引物之间形成二聚体的自由能较低容易发生错误引发： 分别是：F2/ F2 ，B3/ F3 ，B3/ F2 ，B3/ F1c ，B2/F1c ，B2/B2 详细情况参见文末附件 4. ΔG(最佳：引物的3’和FIC BIC 的ΔG 5’-4) 结果均符合要求！ （以上详细情况参见文末附件） 广州迪澳生物科技有限公司 广东省广州市科学城科学大道 182 号 创新大厦C2-1303