碱性磷酸酶km值测定实验报告.docx

碱性磷酸酶km值测定实验报告 篇一：碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析　　碱性磷酸酶Km值得测定　　【实验目的】　　1.了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；　　2.掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；　　【实验原理】　　1.在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度　　[S]增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：　　Vmax?[s]V?Km?[S]　　2.本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应如下：　　磷酸苯二钠?H2O?????苯酚?Na2HPO4　　苯酚?4-氨基安替比林???????醌类衍生物（红色）　　【实验器材与试剂】　　器材：试管架，试管，移液管，移液枪，恒温水浴箱，721型分光光度计　　试剂：0.02mol/L底物液，pH=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾 K3Fe(CN)6,OH?AKP,OH?　　【实验步骤】　　试剂 1 2 3 4 5 6 7 空白 0.02mol/L 0.05 0.10 0.20 0.40 0.600.801.00 0.00 底物液　　pH= 10 0.90 0.90 0.90 0.90 0.900.900.900.90 碳酸缓冲液　　蒸馏水 0.950.900.80 0.60 0.400.20 0.00 1.00　　混合水浴37℃，预温5分钟　　酶液0.1 0.1 0.1 0.10.1 （0.5mg/ml）　　加入酶液后立即混匀，37℃水浴保温，反应开始。并开始计时，反应时间为15 min　　碱性溶液1.0 1.01.01.0 1.0 1.0 1.01.0 4 -氨基安1.0 1.01.01.0 1.0 1.0 1.01.0 替比林　　铁氰化钾2.0 2.02.02.0 2.0 2.0 2. 02.0 混匀，室温放置10min左右，以空白管调零，　　测定各管的吸光度（A510） 　　时间步骤现象 分析 　　15 :50 配好底物混合液 无明显现象　　并开始预热　　15: 55 预热结束并加入酶液 无明显现象　　水浴15min　　16: 07 水浴结束，依次加入 1-5号管红黄 生成酚类碱性溶液等试剂，混 颜色依次加深 衍生物， 匀，置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反 应未完全 16: 17 测定各管吸光度　　【实验结果记录与处理】　　试管编号 12(转载自：www.xiaocaOfaNW 小草 范 文 网:碱性磷酸酶km值测定实验报告)34567 8 A5100.030 0.0530.0970.158 0.232 0.1190.128 0.0 数据处理　　试管编号 1234567 8 底物浓度0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10 0 mmol/L　　1/[S] 21 0.5 0.250.1670.1250.100 1/A51033.3318.87 10.31 6.33 4.318.40 7.810 以1/[S]为横轴，1/A510为纵轴作图： 　　【计算】 　　根据y = 15.071x + 3.3668，当y=0时，x=-0.2234，继而Km=2.61mmol/L　　【实践与思考】　　1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？　　在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。　　2.Km值在酶动力学研究中有什么意义？　　不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大,表明亲和力小；Km值小,表明亲合力大.　　【注意事项】　　1.计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。　　2.各管温度的时间一致。　　分子筛层析（凝胶过滤法）　　【实验目的】　　1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；　　2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。　　【实验原理】　　1.凝胶是由胶体溶液凝结