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第三章 植物基因的克隆原理与技术 内 容 一．基因克隆所需要的酶和载体 二．植物转化载体的构建 三．基因克隆的方法 基因克隆所需要的酶和载体 基因克隆所需要的酶类 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶 质粒载体 酵母ARS ARS (autonomously replicating sequence自主复制序列)---染色体自主复制序列,是从酵母中克隆的真核细胞DNA复制起点序列。 酵母每条染色体由多个复制子组成,复制子平均长度为36kb。 整个基因组约由400多个复制子组成。 酵母整合质粒(YIps) 酵母附加质粒(YEps) YEp克隆载体（酵母游离型质粒） 　2μm质粒的ori　→　EcoRⅠ酶切 pBR322质粒 酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切 　　 YEp24 　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （图3-11） 特征 　（1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变 优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因 一、λ噬菌体克隆载体 λ噬菌体的缺陷： 构建λ噬菌体载体的基本原理 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：　　插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。　　替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。 λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 插入型载体 置换型载体 柯斯质粒载体 cosmid vectors 能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）载体。 组成：质粒复制原点，抗性基因，多克隆位点，已连接λ的cos位点。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要其长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可像噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。 柯斯克隆理论依据是: 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。 2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。 3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。 人工染色体载体 质粒的提取 碱变性法； 煮沸法； SDS法。 基因克隆的方法 基因的分离 基因克隆：就是利用DNA重组技术及其它相关技术，获得目的（外源）基因（DNA片段）并插入适当的载体DNA分子中，并能自我“复制”，获得大量目的基因（DNA片段）的过程。 目的基因的制备: 构建基因组文库 构建cDNA基因文库 利用聚合酶链式反应技术 基因的化学合成 基因文库 基因组文库构建 基因组文库必须符合的基本条件 文库能够覆盖整个基因组； 插入的片段比较大； 文库比较稳定，且容易保存和操作。 基因组文库的大小： N=ln(1-P)/ln(1-f) N：文库必需的克隆数 P：文库中目的DNA片段的出现概率 f：插入片段大小/全基因组大小的比值 植物基因组文库构建的基本步骤： 大片段DNA克隆载体的准备； 大分子质量的植物基因组DNA制备； 大片段DNA分子的部分酶切； 载体与外源片段的连接； 载体的遗传转化。 cDNA文库 基因组文库 包含该生物基因组DNA全部的序列； 是具有生物种属特异性的。 cDNA文库 已经过剪接、去除了内含子的cDNA； 具有组织细胞特异性。 cDNA文库的构建 载体cDNA片段的