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第四章 发酵工业的无菌技术 第一节 发酵工业污染的防治 纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作； 染菌无法彻底避免；据报道： 国外抗生素发酵染菌率为2％~5%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为1％～2％。 染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。 一、污染的危害 1、染菌的不良后果 消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大 2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。 B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 。 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。 （2）染菌种类对发酵的影响 青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染 （3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 ①种子扩大时期染菌:灭菌后弃去。 ②发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。 ③发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。 抗生素发酵 ：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。 柠檬酸发酵： a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌 。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。 ④发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵。 污染严重，则提前放罐。 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价。 （4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法： ①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。 二、杂菌污染的防治 1、染菌的检查与类型判断 (1)显微镜检查法：菌体 (2)平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 (3)肉汤培养检查法 （酚红变色pH6.8-8.4） 以上方法缺点： 镜检出杂菌需要一定时间。 (4)发酵过程的异常现象判断 DO2水平异常变化： pH异常变化： 污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌 尾气CO2异常变化： 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。 2. 污染原因分析 主要原因： ①?种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善 (1)从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。 球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、 无菌空气带菌、 设备渗漏、操作失误有关。 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与操作失误、 技术管理不善有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。 (2)从污染时间看： 早期污染可能与?种子带菌、无菌空气带菌、灭菌不彻底 、操作失误 有关。 后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料有关。 (3)从染菌幅度看： 各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题。 个别罐连续染菌，一般是设备问题。 3、杂菌污染的途径及其预防 (1)种子带菌的防治 灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。 保藏可靠： (2)过滤空气带菌的防治 提高空气进口的洁净度。 除尽压缩空气中的油和水。 保证空气过滤器介质的填装质量。 (3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、