实验九-动物组织中核酸的提取和鉴定.docVIP

实验七　动物组织中核酸的提取和鉴定 【原　理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3 H3PO4·6MoO3 ·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。 (2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。 上述二反应如下 【操　作】 (一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定： 取中试管2支，标号、按下表操作： 管　号 试　剂 核酸水解液 5%硫酸 二苯胺试剂 1（测定管） 24滴 — 30滴 2（对照管） — 24滴 30滴 摇匀，于沸水浴中加热15分钟后，观察二管颜色之变化。 3、核糖的鉴定： 取中试管2支，标号，按下表操作： 管　号 试　剂 核酸水解液 5%硫酸 拜耳氏试剂 1（测定管） 6滴 — 9滴 2（对照管） — 6滴 9滴 摇匀，于沸水浴加热10分钟后观察色颜色之变化。 4、磷酸的鉴定 取中试管二支，标号、按下表操作： 管　号 试　剂 核酸水解液 5%硫酸 钼酸试剂 3%维生素 C 1（测定管） 10滴 — 5滴 4滴 2（对照管） — 10滴 5滴 4滴 摇匀，于沸水浴中2～3分钟后，观察二管颜色之变化。 【试剂配法】 1、饱和苦味酸溶液：称取1.3克的苦味酸，溶于100ml的蒸馏水中，静置过夜。临用前倒取上层液。 2、钼酸试剂，称取钼酸铵5克，溶于100ml蒸馏水中，再加入浓硫硫15ml待冷却后加蒸馏水至1000ml，此试剂可置阴凉处保质一月。 3、拜耳（Bial）氏试剂：称取1.5克3，5一二羟甲苯，加入浓盐酸50ml。再加10％三氯化铁20—30滴，贮于冰箱。此试剂应在临用前配制。 4、二苯胺试剂：称取纯二苯胺lg溶于1000ml的冰醋酸中，加入浓硫酸2.75ml，贮于棕色瓶中，此试剂亦需临用前配制。 5、3％维生素C：称取维生素C 3克溶于5％三氯醋酸100ml中（已氧化变质的维生素C不能用）。 【注意事项】 1、在用饱和NaHCO3调节pH值时