产EPA土壤真菌的高通量筛选及发酵调控研究-微生物学专业论文.docx

华 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 I I 摘 要 二十碳五烯酸(5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid，简称 EPA)属于 ω-3 系列多不 饱和脂肪酸，在防治心血管疾病、抗癌、抗炎等方面具有重要作用。利用微生物发 酵生产 EPA 具有周期短，不受原料、气候、产地的限制，易于规模化生产等优点， 是近年来国内外的研究热点。 本研究首先建立了产 EPA 土壤真菌的高通量筛选方法，即以 EPA 合成途径的关 键酶基因作为分子标记，基于 PCR 扩增进行定向初筛，再对初筛所得菌株的油脂成 分进行 GC-MS 检测，最终确定 EPA 高产菌株。筛选所得菌株 RBB-2 和 RBB-5 油脂 中 EPA 含量分别为 6.95%和 9.90%，EPA 产量分别为 215.81 mg/L 和 263.80 mg/L。 该方法简化了筛选过程，极大地提高了筛选效率。 从形态特征、生理生化特征以及 18S rRNA 序列分析等多方面对 EPA 产量较高 的菌株 RBB-5 进行分类鉴定，结果表明，菌株 RBB-5 的形态和生理特征与腐霉属的 特性相同，且其 18S rRNA 序列与 Pythium splendens 117 的 18S rRNA 序列相似度为 99%，因此，将其归属于华丽腐霉，并命名为 Pythium splendens RBB-5。 通过研究影响 EPA 合成的主要因素，结合发酵过程中菌体生长、油脂积累、EPA 合成以及溶氧变化的规律，确立了优化的发酵调控方法，即 25°C 发酵至 96 h，程序 降温至 15°C；0-72 h 调节通气比为 0.8 vvm，72-168 h 调节通气比为 1.2 vvm；发酵 至 72 h 时，向培养基中添加 60 g/L 豆芽汁；继续发酵至 168 h。在此条件下培养的 菌体，其生物量为 26.20 g/L，油脂含量为 16.08%，油脂中 EPA 含量为 22.87%，EPA 产量达 963.50 mg/L。 采用根癌农杆菌 LBA4404 介导，以华丽腐霉 RBB-5 孢子为受体材料，对影响转 化效率的因素，如转化过程中农杆菌的浓度、共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度、 共培养时间和共培养温度等进行分析，建立并优化了农杆菌介导的华丽腐霉 RBB-5 遗传转化体系，为构建 EPA 高产基因工程菌奠定了基础。 关键词：二十碳五烯酸 菌种筛选 华丽腐霉 发酵调控 农杆菌转化 II II Abstract EPA (5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentaenoic acid), belongs to the ω-3 polyunsaturated fatty acids. It plays an important role in preventing and treating cardiovascular disease, anti-cancer, anti-inflammation, and so on. Production of EPA by microbial fermentation is the hotspot in recent years because of its merits such as short cycle, free influence in raw material, climate, producing area and easy-to-scale production. In this study, a high-throughput screening method was established to screen EPA-producing fungi. The genes of key enzymes in EPA biosynthesis were used as molecular markers for targeted screening based on PCR amplification. And the lipid composition of the obtained strains was detected by GC-MS, then the EPA-producing strains were finally confirmed, in which the EPA contents were 6.95% and 9.90%, respectively, and EPA yield were 215.81 mg/L and 263.80 mg/L, respectively. Thus, the screening process was simplified, a