多壁碳纳米管和富勒烯碳60对星形胶质细胞功能的差异性影响-劳动卫生和环境卫生学专业论文.docx

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE PAGE 3 多壁碳纳米管和富勒烯碳 60 对星型胶质细胞功能的差异性影响 华中科技大学同济医学院公共卫生学院 博士研究生 ： 陈效 导师 ： 徐顺清, Hermann Schluesener （图宾根大学，德国） 中文摘要 当一种材料的组成颗粒的三维尺寸中至少有一维介于 0.1～100 纳米之间时，该材 料即可称为纳米材料。纳米材料不但具有迥异于宏观材料的理化性能，还可表现出独 特的生物学效应；纳米材料的理化特征是决定其生物学效应的关键因素。多壁碳纳米 管（MWCNTs）和富勒烯碳 60（C60）是碳的两种同素异形体，同时也是具有独特分 子结构、理化和生物学性能的纳米材料。MWCNTs 和 C60 与神经组织的相互作用是目 前的热点研究领域，并且这两种碳基纳米材料已表现出在中枢神经系统（CNS）的巨 大应用潜力。但由于 CNS 的复杂性，在将 MWCNTs 和 C60 安全而有效地引入 CNS 之 前，尚需开展全面和细致的研究以确保其应用的安全性和有效性。 星形胶质细胞是 CNS 十分活跃的细胞成分，其在人脑中的数量十倍于神经元，在神经系统的结构和生 理、病理功能方面发挥着至关重要的作用。但目前有关纳米材料与 CNS 相互作用的研 究主要集中于神经元而较少关注胶质细胞。有鉴于此，本课题对原型 MWCNTs 和 C60 与大鼠星形胶质细胞和由人星形胶质细胞转化而来的胶质瘤细胞的相互作用开展了研 究。本课题包括以下三部分内容。 第一部分 多壁碳纳米管和富勒烯碳 60 对细胞活力的影响 细胞活力检测是任何细胞水平研究的常规和基础性工作。噻唑蓝（MTT）和刃天 青（resazurin）还原法是目前广为应用的两种细胞活力检测法。但我们发现，MTT 和 resazurin 法并不能准确反映 MWCNTs 对细胞活力影响。为能准确检测 MWCNTs 的细 胞效应，我们建立、验证了一系列基于流式细胞技术（FCM）的方法，并行之有效地 用于研究 MWCNTs 对星形胶质细胞的效应。作为对照，C60 的细胞效应也经相同的方 法进行了分析。JC-1、DiOC6(3)、R123、FDA 和 PI 是反映细胞不同功能的荧光探针。 我们首先对它们的染色指征进行了表征。结果表明 JC-1 和 DiOC6 (3) 染色是线粒体膜 电位 (ΔΨm) 的良好指标。ΔΨm 是细胞摄取 R123 的驱动力，但细胞膜转运蛋白 Pgp 对 细胞内 R123 的含量有决定性的影响。而另一种细胞膜转运蛋白 MRP 则是细胞 FDA 染 色的决定因素。随后分别以上述探针在原位（in situ）和非原位（ex situ）条件下对经 MWCNTs 和 C60 处理（24h）的细胞进行染色，并 FCM 进行分析。结果显示，在 in situ 条件下，MWCNTs 显著降低 JC-1 和 DiOC6(3)的细胞染色但却增强 R123 和 FDA 的染 色。而在 ex situ 条件下，除 FDA 外，MWCNTs 对其他探针的染色无显著影响。与 MWCNTs 相比，C60 对上述探针的细胞染色无显著影响，in situ 和 ex situ 染色结果也 无显著差异。显微镜观察显示 MWCNTs 和 C60 对细胞形态无明显影响。上述结果表 明：1.探针的染色方式对染色结果有着根本影响提示，2. 在本实验的暴露浓度和时间 的条件下，MWCNTs 和 C60 不影响细胞的总体活力，3. 但涉及细胞膜的一些细胞功 能可能发生改变, 4. 荧光探针结合 FCM 可方便、有效地反映 MWCNTs 的细胞效应。 关键词：多壁碳纳米管；富勒烯碳 60；星形胶质细胞；细胞活力；流式细胞检测 第二部分 多壁碳纳米管和富勒烯碳 60 对跨细胞膜物质转运的影响 细胞膜是维持细胞形态和完成细胞生命功能的重要结构，同时也是细胞与纳米材 料相互作用的起始界面。跨膜转运以实现细胞内外的物质交换是细胞膜的一个重要功 能。细胞膜转运蛋白如 Pgp 和 MRP 是完成跨膜物质转运的重要机制。我们在前面的工 作中观察到 MWCNTs 能提高细胞内罗丹明 123(R123)和荧光素(Flu)的含量。R123 和 Flu 分别是 Pgp 和 MRP 的特异性转运底物，因此推测 MWCNTs 可能影响细胞膜，尤 其是 Pgp 和 MRP 介导的跨膜转运。在此部分工作中我们即对此假设进行了检验：以 MWCNTs 处理星形胶质细胞后，分析了细胞对 Pgp 和 MRP 特异性底物的摄取、潴留 和外排动力学。Pgp 的底物为 R123 和阿霉素（DOX）；MRP 的底物为荧光素（Flu） 和羧基荧光素（CF）；并仍以 C60 作为对照。结果表