病毒和病毒成份的提纯-医学课件.doc

PAGE 1 go 第十四章 病毒和病毒成份的提纯 一、病毒的提纯 (一)沉淀法 (二)层析法 (三)两相溶剂间分配系数法 (四)红细胞吸附法 (五)电泳法 (六)超速离心法 (七)超滤法 二、病毒蛋白亚单位的分离 三、病毒脂质的抽提 四、病毒糖类的抽提 一、病毒的提纯 所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。 病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。 1.物理均一性 测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。 2.病毒滴度与蛋白含量的比例 测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。 3.免疫学反应 免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。 4.结晶形成 病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。 病毒提纯的主要依据和条件有: (1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯； 而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、 蛋白酶解等物理和化学的方法。 通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～ 6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。 (2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。 (3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。 (一)沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀， 且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量， 用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于毒悬液中, 使其达到所需浓度,通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法 甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法 病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法 Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH 8.5），又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法 鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时,病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。 (二)层析法 病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸