基本原理酶联免疫吸附试验.PPT

放射免疫技术——是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的免疫测定技术。 最常用的核素：125I和3H ，125I是目前常用的RIA标记物。 类型：放射免疫分析（RIA）和免疫放射分析（IRMA） 放射免疫分析（RIA）——是以核素标记的抗原与受检标本中抗原竞争特异性抗体来测定待检样品中抗原含量的方法。为经典模式。 基本原理 标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。 抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。 二、测定方法 用放射免疫分析进行测定时分三个步骤： 1.抗原抗体的竞争抑制反应 2.B和F的分离 3.放射性的测量 抗原抗体反应 将抗原（标准品和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。 如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（15～37℃）进行较短时间的温育，反之应在低温（4℃）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。 B、F分离技术 　1．第二抗体沉淀法：这是RIA中最常用的一种沉淀方法。在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原－第一抗体－第二抗体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（B）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F）分离。 2．聚乙二醇（PEG）沉淀法：最近各种RIA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。PEG沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。 3．PR试剂法：是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。 4．活性炭吸附法：小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子复合物留在溶液中。放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素，强心糖苷和各种药物。 放射性强度的测定 液体闪烁计数仪（β射线，如3H、32P、14C等）和晶体闪烁计数仪（β射线，如125 I 、131I、57Cr等）。 计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。 每次测定均需作标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。 放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(B＋F)、B/F和B/B0。标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。 免疫放射分析（IRMA）——是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析。 免疫放射分析 特点：用核素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。 一、基本原理 单位点IRMA：（1）放射性核素标记的过量抗体+待测抗原，形成抗原抗体复合物；（2）反应平衡后，采用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离；（3）测定上清液的放射量。属固相免疫标记测定，为非竞争放射免疫分析。 双位点IRMA：先用固相抗体跟抗原反应结合，然后再用放射性核素标记的过量抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定蔟结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物（双抗体夹心），洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。 应 用 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。 由于其具有放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长，以及具有不易快速、灵活的自动化分析等诸多不足，终将会别其他非放射性标记免疫测定所取代。 流式细胞仪 【基本原理】 【基本原理】 定义：酶免疫技术是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。 应用： 酶免疫技术 应用日益广泛，是取代放射免疫技术的主要方法之一。 酶免疫技术的特点 1.酶免疫技术是： ①酶催化底物反应的生物放大作用； ②高度特异性、敏感性的抗原-抗体反 应的一种检测方法。 2.优点： ①灵敏度高、特异性强、准确性好； ②酶标记试剂能够较长时间保持稳定； ③方法简单安全易行。 一、酶免疫技术的基本原理 是以酶标记的抗原（或抗体）与受检标本中抗体（或抗原）特异性结合形成抗原