第5章-蛋白质结构解析.pptVIP

通过计算得到不同波长的θ(λ)，得出计算曲线。假设一些不同的Xβ值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线，相应于该最接近曲线的Xβ及XR即认为是该蛋白质的相应结构含量。 Example fit: myoglobin(肌红蛋白) In this case: qt = xaqa + xbqb + xcqc fits best with xa = 80%, xb= 0% xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coil 激光拉曼光谱 激光拉曼光谱法是研究生物大分子结构、动力学及功能的重要手段，它在物理、化学、医学及生物学等领域都有着十分重要的应用价值。 在蛋白质等结构研究方面，拉曼光谱分析可以提供大量的信息，促进蛋白质等生物大分子研究进展。 1928年，印度物理学家拉曼(Raman)发现了拉曼光谱，同时期的苏联物理学家兰斯伯格(G. Landsberg)也独立地发现了这一现象。从那时起，拉曼光谱逐渐发展成为一个分析物质结构的有力工具。 然而由于拉曼光谱技术强度很弱，时间较长，测定有色物质和发光样品存在困难等缺陷,给其应用带来了很大困难,故在后来很长一段时间内发展比较缓慢，曾一度有被红外光谱取代的趋势。 直到1960年激光出现以后，由于激光具有高亮度、单色性和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。 质谱(mass spectrometry，MS) 自美国科学家John B.Fenn和日本学者田中耕一(Koichi. Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。 生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。 质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。 质谱分析基本原理 质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。 其过程可简单描述为： 离子源轰击样品→带电荷的碎片离子→电场加速(zeU)→获得动能(mv2)→磁场分离→检测器记录 其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，v为电子运动速度。 质谱分析(MS)的特点 MS用于生物大分子的研究具有以下优点: 高灵敏度 易操作性 准确性 快速性 很好的普适性 高灵敏度能为亚微克级试样提供信息，可以有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。 质谱分析的方法 近年来出现的较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种： 电喷雾电离质谱 基质辅助激光解吸电离质谱 快原子轰击质谱 离子喷雾电离质谱 大气压电离质谱 在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛。 蛋白质的质谱分析 质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。肽和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。 蛋白质质谱分析原理为：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 蛋白质的质谱分析方法 MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法： 第一种方法称为蛋白图谱(protein mapping),它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,将所得肽谱数据输入数据库,有哪些信誉好的足球投注网站与之相对应的已知蛋白,从而获取待测蛋白序列； 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基； 第三种方法称为梯状测序(ladder sequencing)，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，再经质谱检测，由相邻峰的质量差可知相应氨基酸残基。 质谱中主要出现的离子有四种，即分子离子、碎片离子、同位素离子和亚稳离子 分子离子 分子在离子源中失去一个电子形成的离子，在质谱图中，分子离子对应的峰称分子离子峰。 特点： 分子离子含奇数个电子，分子离子峰出现在质谱图的最右侧。 作用： 根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。 碎片离子：分子离子中的某个化学键断裂而形