二氮嗪对新生大鼠缺氧缺血脑损伤后细胞骨架蛋白稳定作用分析-儿科学专业论文.docx

二氮嗪对新生大鼠缺氧缺血脑损伤后细胞骨架蛋白稳定作用研究 Effects of Diazoxide on the stability of the neural cytoskeleton, F-actin, in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage 硕士生：罗红凤 导 师：林霓阳 教授 院 系：医学院 专 业：儿科学 方 向：新生儿 本课题为广东省自然科学基金（NO.S2011010005065）和 汕头市科技计划项目（汕市财教【2011】134号）资助课题 中国 汕头 二?一三年 中文摘要 目的 采用宫内窒息诱发新生鼠缺氧缺血脑损伤（hypoxic ischemic brain damage，HIBD）模 型，探讨线粒体 ATP 敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive K+ channels，mitoKATP）开 放剂二氮嗪是否可通过稳定纤维形肌动蛋白（fibrous actin，F-actin）发挥对新生大鼠 HIBD 后的保护作用，为临床上开发 mitoKATP 通道开放剂治疗新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）提供实验依据。 材料与方法 取孕 21 天 Sprague Dawley（SD）大鼠麻醉后剖腹，结扎其子宫动静脉建立宫内窒息 诱发新生大鼠 HIBD 模型, 剖宫产取出的新生大鼠分为假手术组、窒息组、 二氮嗪组、二 氮嗪+格列苯脲组及溶剂组，其中假手术组仅行剖宫产术而不予结扎子宫动静脉。取出新 生大鼠后 0h、12h、24h 分别腹腔注射相应药物。采用光学显微镜和电镜观察神经细胞组 织学改变，2，3，5-氧化三苯基甲氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate， TTC）染色试验方法及蛋白质印迹（western blot）方法分别观察 HIBD 后脑缺血情况及脑 皮质 F-actin 蛋白表达情况。所有数据均以均数±标准差（ x ??s ）表示，采用 SPSS for Windows 17.0 统计软件进行资料分析，采用单因素方差分析比较组间差异，各组间两两比 较以最小显著差值法分析，P＜0.05 表示差别有统计学意义。 结果 1. HE 染色观察脑细胞损伤病理改变 假手术组脑细胞结构完整、排列有序，细胞周围间隙正常，细胞核清晰可见，胞浆染 色均匀。窒息组细胞密度明显减低，排列紊乱，可见大量细胞水肿，神经元数目减少，部 分区域可见大片细胞核固缩等坏死性改变及神经胶质细胞增生。二氮嗪组细胞排列较整 齐，组织结构基本完整，大部分细胞核清晰可见，神经细胞的坏死及变性程度较窒息组明 显减轻, 可见部分神经细胞水肿。二氮嗪+格列苯脲组细胞密度减低，细胞周围间隙增宽， 部分区域可见局灶性坏死。溶剂组细胞排列较紊乱，细胞密度减低，细胞核出现固缩、溶 解表现，胞浆染色不均。 2. TTC 染色观察脑缺血程度改变 I 宫 内 窒 息 剖 宫 产 后 24h 新 生 大 鼠 出 现 明 显 脑 缺 血 ， 脑 片 平 均 光 密 度 明 显 降 低 （156.3±13.6），与假手术组相比（222.1±21.1）差异有显著性（P＜0.01）。二氮嗪明显减轻 脑缺血程度，脑片平均光密度显著升高（204.6±14.9），与窒息组相比差异有显著意义（P ＜ 0.01 ）。 格 列 苯 脲 抵 消 了 二 氮 嗪 的 脑 保 护 作 用 ， 明 显 降 低 了 脑 片 的 平 均 光 密 度 （166.8±17.2），与二氮嗪组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 3. 电镜观察神经细胞超微结构改变 假手术组细胞内线粒体、粗面内质网和高尔基体均很清楚，线粒体数量多，结构清楚， 嵴排列规整。窒息组线粒体数目明显减少，线粒体结构模糊不清，嵴紊乱、缩小和部分消 失，线粒体出现空泡样改变，粗面内质网脱颗粒，高尔基复合体裂解。二氮嗪组神经细胞 结构基本正常，粗面内质网和高尔基体尚清楚，较多线粒体结构相对完整，部分线粒体稍 肿胀，基质减少，嵴排列稍不规整。 4. western blot 结果 窒息组皮质 F-actin 蛋白量明显低于假手术组（P＜0.01）；二氮嗪干预后皮质细胞骨架 崩解减少，F-actin 蛋白量增加，与 HI 组相比有显著差异（P＜0.01）；格列苯脲可逆转二 氮嗪对细胞骨架的稳定保护作用，细胞骨架崩解增加，F-actin 蛋白量与二氮嗪组相比有统 计学意义（P＜0.01）。 结论 1. 宫内窒息后新生大鼠出现明显的缺氧缺血脑损伤，表现在：细胞形态出现明显的病理改 变如细胞水肿、变性及坏死；脑缺血程度严重；细胞超微结构如