口蹄疫病毒快速检测方法建立.pptVIP

Asia1 型口蹄疫病毒胶体金免疫层析检测方法的建立 导师： 摘要 本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒, 标记纯化的抗 Asia1 型口蹄疫病毒的单克隆抗体, 将该标记物与羊抗豚鼠 IgG 分别包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane)上, 作为检测带和质控带。经条件优化, 组装成检测 Asia1 型口蹄疫的诊断试纸条。 用该试纸条分别对 A、O 和 Asia1 型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等96份样品进行了检测, 发现该试纸条不与口蹄疫病毒 A、O型以及猪水泡病病毒抗原发生反应, 特异性良好。 用该试纸条对口蹄疫细胞毒(TCID50为 6.25)的 10 倍系列稀释液进行了检测, 最低可以检测到大约 10-5。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为 98.8%。 初步实验确定该试纸条在 4℃下可保存 3 个月、37℃ 和室温下大概可保存 1 周左右。 该试纸条是一种快速、灵敏、特异的 FMD抗原检测方法, 对现场检测具有一定实用价值。 材料和方法 结 果 讨 论 结 论 材料和方法 材料 Asia1 型 FMDV 及其他型 FMDV、猪水泡病病毒 (SVDV)乳鼠抗原、健康乳鼠组织样品 四氯金酸(HAuCl4)和聚乙二醇(PEG20000)、柠檬酸三钠、碳酸钾 酪蛋白、 牛血清白蛋白、聚乙二醇 (PEG-1500)及 BSA NC膜、滤器和滤膜 玻璃纤维膜、无纺布、吸水垫、不干胶以及 PVC 垫板 材料和方法 单克隆抗体的纯化及效价测定 体内诱生腹水法：6~8周龄健康 Balb/c 小鼠, 按 0.5 mL/只腹腔注射经高压灭 菌 的 液 体 石 蜡 , 7~10 d 后 每 只 小 鼠 腹 腔 接 种1×106~5×106 个杂交瘤细胞, 经 7~10 d 后可见小鼠腹部明显膨大, 无菌操作采集腹水。 腹水收集：腹水经 1000 r/min离心 10 min, 弃去上层脂肪层, 收集中层腹水, ?70℃冻存备用。 传代：下层细胞仍可按前述方法继续传代诱生腹水, 以进一步获得大量的单克隆抗体。 材料和方法 胶体金的制备 柠檬酸三钠还原法: 称取 HAuCl4 用三蒸水配制成终浓度为0.01%的溶液。取 100 mL 0.01% HAuCl4 溶液加热至沸腾 , 迅 速 加入 新 配 制 的 1% 的 柠 檬酸 三 钠溶 液2 mL, 继续煮沸 , 直至溶液变成酒红色, 冷却后加入三蒸水恢复至原体积。 胶体金的鉴定方法：通过肉眼观察和电镜观察 评价标准：质量好的胶体金颜色呈酒红色, 透明度好, 无混浊现象。 材料和方法 金标记抗体的制备 离心法: 1) 取一定量的金溶液, 加入单克隆抗体后 , 搅拌 20 min,置于 4℃ 30 min。 2) 按照金溶液体积的 0.04%加入PEG20000 稳定剂。 3) 搅拌 20 min, 置于 4℃, 2 h 以上。 4) 2000 r/min 离心 10 min, 弃沉淀。 5) 8000 r/min离心 30 min, 保留沉淀。 6) 将沉淀用金稀释液悬浮,最终体积为原始体积的 8%。 保存备用：用无纺纱浸湿, 于 37℃烤箱中 , 干燥平整成金标记抗体反应膜备用。 材料和方法 测试条的组装和切割 测试条的主要构成： PVC 塑料板是反应体的支撑物; 在塑料底板上分别将玻璃纤维素膜、干燥金标记单抗玻璃纤维素膜、已固定有配对单抗和羊抗豚鼠 IgG 的 NC 膜及吸水滤纸 试纸裁剪:装配好的纸板按纵向剪切, 裁成宽度为 4 mm 的条状, 即为检测试纸条 NC 为反应膜, 显示整体系统的反应结果 T 线、C 线两点依次为检测线、 对照线 手柄吸水垫为粗纤维吸水纸 PVC 与样品吸收垫之间 , 以及 NC 膜之间都需要用胶固定 , 上层再粘贴一层纤维布 , 可加速吸水。 材料和方法 测试条的初步试验 分别用生理盐水、 PBS(0.01 mol/L)和 Asia1 型FMDV(1:1000 稀释)标准细胞毒 3 种液体进行测试。 材料和方法 金标试纸条的特异性试验 用金标试纸条分别对 Asia1 型、 A 型及 O 型FMDV 细 胞 毒 , C 型 表 达 抗 原 和 猪 水 泡 病 病 毒(SVDV)进行测试。同时出现检测线和质控线的判为阳性, 只有质控线而无检测线的为阴性, 若质控线不出现为无效需重