临床免疫学检验质量保证.pptVIP

方法学性能验证 实验方案 实验计划 实验实施 实验报告 标准操作规程的建立 在免疫测定中，试剂准备、加样、温育、洗板、显色和测定等每一步骤均可能对测定结果产生较大影响 因此，需要将每个操作步骤标准化并形成“标准操作程序”（SOP），所有操作人员必须按照SOP进行试验操作 加样 ◎在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。 ◎加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 ◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。 加样 ◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。 ◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。 ELISA竞争法的本质：酶标抗体与样本抗体在同样体系中，与固相抗原竞争结合是等比例关系。 正确的加样：应该先将样本与酶标抗体混合均匀，然后加入孔中反应。 实际工作中 分开加 分开加会造成先加入的先结合，与后加入者并不是公平竞争关系，也不符合等比例原则。特别是在放置时间过长，温度过高的情况下，对结果的影响很大。 有研究表明，2min后加入酶标抗体，由于标本比酶标抗体先结合了2min，因此可出现7.4%的假阳性。30min后再加，假阳性率高达57.4%。 温育 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后的显色反应。 温育常采用的温度有43 ℃、37 ℃、室温和4 ℃（冰箱温度）等。37 ℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的。 同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。 显色和比色 ◎HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度。 ◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止。 ◎显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。 报告方式 定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告，S为标本A值，C.O即Cut Off值（阳性判定值) ◎夹心法和间接法以S/C.O≥1为阳性； ◎竟争法与中和法以S/C.O﹤1为阳性 室内质量控制 定量室内质量控制：L-J质量控制图 定性室内质量控制 定性室内质量控制 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证： 控制提供反应的仪器/系统的稳定性（灵敏度和特异性）。 检出假阳性反应和假阴性反应（即符合率和一致性）。（保证检测结果阳性就是阳性、阴性就是阴性） HOOK效应的监控。 质控物的选择： 质控物来源：均采用自制质控物质。 浓度梯度的设置： （1）阴性质控：0.5倍Cut Off值附近的阴性OD值 （2）阳性质控： ?弱阳性质控：2-4倍Cut Off值附近的弱阳性OD值 ?阳性质控：试剂盒所带阳性对照OD值 控制提供反应的仪器/系统的稳定性 建议采用弱阳性质控物作Levey-Jennings质控图，横坐标（X轴）表明的是检测日期，纵坐标（Y轴）用吸光度值表示。 旨在监测和控制本室常规工作的精密度、灵敏度，提高批内批间样本检验的一致性 检出假阳性反应和假阴性反应 建议采用Westgard质控规则改良法对第三方阴性、弱阳性质控进行分析 绘制中心线和上下失控限三条线，中心线为质控物测量均值，利用临界值（cut off值）验证值确定上下失控限。 * * * 临床免疫学检验（ Clinical Immunoassay） 昆明医科大学附属甘美医院检验医学教研室 田 敏 (Min Tian) 第十九章 临床免疫学检验的质量保证 第一节 分析前质量控制 第二节 分析中质量控制 第三节 分析后质量控制 目的要求 掌握免疫学检验质量控制的有关概念及质量控制原则 掌握标本的正确收集及处理 熟悉常用免疫学检验的质量控制、室