流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析-(精选·公开·课件).ppt

流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析 东北师范大学生物基础实验教学中心 巴雪青 流式细胞术（flow cytometery, FCM）是20世纪70年代发展起来的一种可以快速、准确、客观，可同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。 流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞仪的特点 单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒 其结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测、存储、显示分析系统；细胞分选系统。 （一）流动室与液流驱动系统 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 (二)激光光源与光束形成系统 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。 (三) 光学系统 流式细胞仪的光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成， 主要光学原件是滤光片，主要分成3类：长通滤片(long-pass filter，LP)、短通滤片(short-pass filtr，SP)及带通滤片(band-pass filter，BP)。 它们分别将不同波长的荧光信号送到不同的电子探测器 (四) 信号检测与分析系统 1．散射光信号： 散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。 前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性 (1)前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 (2)侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90°方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 2．荧光信号 (1)荧光信号的线性测量与对数测量 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来的10倍时，输出为2；当输入增大到原来的100倍时，输出为3等。 (2)荧光信号的面积和宽度 所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，均采用面积(FL2－A)来计算。这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。 荧光信号的