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绵羊黑色显性毛色分子学和药理学特性
绵羊黑色显性毛色的分子学和药理学特性 小组成员:杜晓丽 连维思 张秀玲 张淑娜 1. 背景 材料 过程 2. 3. 4. 结果和讨论 背景知识 1、MC1R(melanocortin-1-receptor gene,黑素皮质素受体)在扩展(Extension)位点编码,其中人的MC1R位于16号染色体上。 2、MC1R主要与黑色素合成有关。MC1R属于G蛋白受体家族中最小的受体,它在黑素细胞和黑色素合成激素的互作中起重要的信号传递作用,是α-MSH(α-促黑色素细胞激素)的受体。 3. Agouti(鼠灰色)基因与MC1R相互作用,agouti基因所编码的蛋白可以抑制α-MSH与MC1R的结合,但是在绵羊和小鼠中extension基因对agouti基因具有上位效应,表明了绵羊的黑色是由ED控制。 4. 在编码绵羊MC1R的基因上有两个自然发生的突变,并且这两个突变与黑色毛色呈现共分离。 研究目的: 研究这两个突变点M73K(老鼠上是M71K)和D121N(老鼠上为D119N)所造成的氨基酸改变,会使得配体和受体的结合产生怎样的影响。 材料 选用挪威的DALA绵羊,这种羊在通常情况下是白色的,但是也会出现毛色全黑的情况。 总共选22只羊,其中9只黑色,13只白色。 研究过程 PCR扩增MC1R基因并测序; 2. 用PCR-RFLP 技术对M73K和D121突变点进行确定: M73K突变点的确定: (1)在20ul的体系中,加入50ng的DNA,10pmol的上下游引物以及200uM的dNTP, 标准缓冲条件和1 U Taq聚合酶。 (2)基因组DNA在95℃下变性3min,PCR在95°C运行15秒,60°C为30秒,和73°C为30秒共35个循环。 (3)15ul的PCR产物在20ul反应中用NlaⅢ在 37°C下消化两小时。 (4)消化过的DNA在4%琼脂糖中进行凝胶电泳。 若是野生型基因存在时,300bp的片段可以被切成118bp,90bp,48bp,27bp以及17bp,若是M73K突变存在时,PCR的产物可以被切成145bp,90bp,48bp和17bp. ? D121N突变点的确定: (1)用设计的另一种引物,以及退火温度为95°C,延伸时间为45秒,其他条件与M73K中的相同。 (2)15ul的PCR产物在20ul反应中用MseⅠ在 37°C下消化两小时。 (3)消化的DNA在2%琼脂糖中进行凝胶电泳。 若是野生型基因存在,754bp的片段不会被切开,当D121N突变存在,754bp切成258bp和496bp. 3.定点诱变 M73K和D121N的突变通过PCR反应进入小鼠的MC1受体编码序列。 (1)设计的两个寡核苷酸的端到端与相反的链杂交,扩增含有小鼠MC1R的整个PBS质粒。 (2)一个引物包含M73K的突变,另一个引物与野生型相互补。 (3)在PCR聚合酶作用下,线性DNA通过琼脂糖凝胶电泳纯化,结合,克隆分离。 (4) mMC1R使用ABI测序仪测序证实。 4.受体表达 将突变了的MC1R亚克隆入pcDNAⅢ载体做表达研究。用20毫克DNA转染人胚肾293细胞,使用磷酸钙法。选择开始于转染后72小时含10%小牛血清和1 mg/ml的遗传霉素培养基中。 5.β-半乳糖苷酶活性的检测 含有野生型mMc1受体和受体突变体的人胚肾293稳定表达细胞系使用钙磷酸盐法转染β-半乳糖苷酶。 (1)4ug的β-半乳糖苷酶基DNA在10厘米的板上进行细胞的转染。 (2)在15-24小时后,细胞在96孔板上分裂,每孔大约有20000到30000个细胞,在转染48小时后进行孵化。 (3)细胞用不同浓度的α-MSH和NDP-α-MSH下进行刺激,并在37°C, 5% CO2培养箱中培养6小时。 (4)刺激后,细胞被溶解在50 mL裂解缓冲液,冷冻并解冻,再估计β-半乳糖苷酶的活性。 6. 配体结合 竞争结合试验在含有野生mMC1受体或是突变受体的稳定细胞系中进行。 (1)将细胞镀在24孔板上,每孔有5×106个细胞,在室温下再将其在结合介质中放置45min每孔含30–100000 CPM 125I NDP-α-MSH。 (2)用不同浓度的未标记的α-MSH和NDP-α-MSH与已经标记的NDP-α-MSH进行竞争性结合。非特异性结合的控制包含1或10uM未标记的α-MSH。 (3)45min后,介质被吸收,用1ml的PBS清洗细胞。 (4)用0.5毫升的Gibco的包用于计数含放射性的试管数目。 结果 Met Lys Asp Asn 在绵羊MC1R基因上的突变: 在
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