04第四讲-蛋白质结构解析技术(一).pptVIP

第一节 蛋白质氨基酸序列分析技术 主要内容 化学法 基因方法 蛋白质分子中二硫键和酰胺基位置的确定 蛋白质测定新技术 一、蛋白质测序的研究历史 N-末端氨基酸的测定方法（主要5类） 1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法） 2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） DNS-氨基酸呈荧光 3、异硫氰酸苯酯法（PITC法） 4、DABITC法（甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯 ）， 形成的DABIH—氨基酸呈桔黄色（有颜色） 5、氨肽酶法 N-末端测定的方法——奠定了序列测定方法发展基础 二、序列测定方法——化学方法 （一）N端测序法 应用最广的N端顺序测定法大多仍以Edman降解原理为基础设计。 利用化学试剂和控制反应条件，从N端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定的方法。 1、Edman降解法——异硫氰酸苯酯（PITC）法 特点： 可以测定氨基酸的排列顺序（包括N端分析）。 适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器 （1）原理： 四点： ① 异硫氰酸苯酯(PITC)偶联 →② ATZ -氨基酸裂解→ ③ PTH-氨基酸转化→④ PTH-氨基酸的鉴定 高效液相色谱（ HPLC） （high performance liquid chromatography） （2） 氨基酸序列分析仪器 以Edman法测序，手工操作繁琐，工作量大 根据Edman降解的原理——自动化分析仪器 自70年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。 灵敏度达0.1 pmol 蛋白 3种代表性的测序仪器简单介绍如下： ① 液相旋转杯序列仪 最初的自动化仪器，对自动化测序意义很大。 测定程序： 整个仪器的“核心”部分是一个反应杯，它由一个马达带动并有调速控制。 蛋白质或多肽样品经导管注入反应杯，通过旋转离心力被均匀地涂在杯壁上，形成一层薄膜，其厚薄可由转速控制。 反应试剂和溶剂分别通过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的N端自由氨基进行Edman反应； 降解下来的ATZ—氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集； 再将ATZ氨基酸→PTH氨基酸→鉴定； 洗涤反应杯，依次循环分析。 特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。 ② 固相序列分析仪 发展的动力和原因： 克服液相旋转杯分析仪的缺点。 多肽不易吸附旋转杯上，样品流失较大； 原理： 蛋白质C端羧基共价固定在惰性载体上，进行Edman降解。 特点： 样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会丢失样品，增加循环次数。 缺点： （1）若多肽中其它残基的羧基与载体结合，影响测定。 如：酸性氨基酸残基（Asp、Glu） （2）测定效率低 ③ 气相蛋白序列分析仪 弹筒型玻璃反应室 反应室容积0.05 ml，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯， 用一种惰性聚合物“polybrene”固定样品。 多肽链与气态试剂反应，完成Edamn降解。 优点： 灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需10~100 pmol； 试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的1／10， 降低了费用； 缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。 趋势：灵敏度不断提高 （3）Edman方法改进 DABITC法：1976年，（华裔科学家）张瑞耀提出 试剂：甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯 替代了 异硫氰酸苯酯（PITC） DABITC： 4-N,N-对甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯 原理： 与PITC相似，形成有色产物DABIH—氨基酸，呈桔黄色 也称为有色的Edman降解法， 氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨 特点： 灵敏度很高，分析小肽段只要几个nanomole样品即可。 但DABITC试剂与多肽N端aa耦合率低（20%-30%），测序干扰大！如何解决？ DABITC—PITC两种方法耦合，更加灵敏可靠。 适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。 异硫氰酸酯进行35S标记：使分析样品更向微量化方向发展。 二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 荧光剂—DNS-Cl，与肽链N端氨基反应生成DNS-肽 经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨基酸，检测灵敏度提高310倍。 乙酸乙酯抽提，层析鉴定，DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。 DNS—Edman测定法 两种方法的结合 DNS法，灵敏的高，但不能连续进行 Edman降解法 思考？ 为何要创新很多方法？ 什么样的方法能延续下去？ （4）氨基酸自动序列仪的使用方法 依据Ednan原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快 测序仪发展方向：微量化、自动化 加样量达到微量：10-9—10-12mol水平 推出从进样到色谱分析一体化分析仪 举例：Shimadzu （日本岛津） 公司 PPSQ-21A 氨基酸自动