动物源性致病菌基因芯片特异性和灵敏度实验分析研究.PPTVIP

动物源性致病菌基因芯片特异性和灵敏度实验研究 王金玲 曹际娟 王芳 沈阳出入境检验检疫局综合技术中心 前 言 细菌感染是人与动物常见病之一，虽然细菌培养、组织学、形态学、生物化学及免疫学方法等都应用于对病原菌的检测,但是都存在一定的不足,如所需时间长、敏感度低等。 近年随着PCR诊断技术的发展，为临床及实验室提供了早期、快速和敏感的检测手段。但PCR技术通常仅对特定病原体进行检测，而在病原菌未明时，需用多种不同引物进行PCR扩增，费时费力。而无论是临床还是实验室，根本不可能应用PCR逐一检测每种可能的病原菌,因而迫切需要一种新的技术来检测病原菌。 基因芯片技术的出现和发展,为检测病原菌提供了全新的手段。 基因芯片技术是利用核酸杂交原理检测未知分子，将核酸片段按照一定顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列。不同来源但序列互补的两条单链DNA或RNA在适宜条件下发生杂交反应，形成双链DNA，或DNA-RNA杂交体。 基因芯片基本过程：先将成千上万的探针固定在支持物上，靶基因先行标记后加至芯片上，标记物可以是一种，也可以是多种，反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用扫描仪进行图像读取，经计算机软件分析综合成可读的信息。 基因芯片的突出特点是高度并行性、多样性、微型化和自动化，可以在短时间内对病原体进行综合检测、分析，并在检测过程中实施各种系统的监控。 目前已经获得了一些病原微生物的全部基因序列或部分基因序列，因此将一种或几种病原体的全部或部分特异的保守序列集成在一块芯片上，可快速、简便地检测出病原体，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。 为了达到能够统一检测的目的,必须选取细菌的保守性序列作为检测对象,如16SrRNA基因、23SrRNA基因和HSP60基因等,其中以16SrRNA 、23SrRNA基因研究最为完善,数据也最全面。 16SrRNA、23SrRNA基因序列除了存在于细菌外，也存在于衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物中。 16SrRNA 、23SrRNA基因是由可变区和不变区组成，二者交错排列。 通过对可变区序列的分析和比较,可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。所以检测细菌核糖体16SrRNA 、23SrRNA基因，可判断细菌感染的存在。 研究目的 以细菌的16SrRNA 、23SrRNA基因为检测对象，设计了寡核苷酸探针，并克隆七种动物源性致病菌16SrRNA 、23SrRNA基因片段，制备细菌检测芯片。 对该检测芯片进行特异性和灵敏度实验研究，并在模拟样品中进行初步应用。 2 克隆质粒的酶切鉴定（图略） 3 克隆质粒的PCR鉴定（图略） 4 克隆质粒的序列分析 用DNAsis软件分析测序结果，表明7种动物源性致病菌16SrDNA 、23SrDNA基因部分片段均成功克隆。 实验二 基因芯片设计 利用生物信息学方法,在大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、小肠结肠炎耶森氏菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的16SrRNA、23SrRNA基因内设计细菌检测芯片探针,并设计待检测靶细菌的扩增引物。 1 18种细菌16SrDNA序列比对结果 2 引物和探针的设计 1 实验过程中易产生非特异性杂交，在实验操作逐步完善、 成熟过程中，该现象会逐渐消失。其中空肠弯曲菌属于厌 氧菌，需在梅里埃公司生产的厌氧袋中培养外，七种致病 菌在基因组DNA提取后，基因芯片的检测流程基本一致。 2 该方法检测时限较短，操作较简单，在检测过程中要注意 DNA污染，可通过一种方法实现同时检测七种致病菌，节 省了时间和人力，但该方法成本较高，对操作人员的技术 要求较高。 3 该芯片仍处于研究阶段，基因芯片检测和鉴定动物源性食 品中病原菌的方法是为食品安全的检验搭建一个技术平 台，但其中还有很多不足之处，如基片的处理、检测的标 记物、仪器扫描的灵敏度等问题，随着基因芯片技术的不 断发展，这些问题都会迎刃而解。随着食品安全出现的新 问题，我们将逐步增加该芯片上需要标记的病原菌，逐渐 实现基因芯片实验室高通量快速检测的目标。 * * 转化 实验方法和结果 实验一 大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特 氏菌、小肠结肠炎耶森氏菌、空肠弯曲菌、志贺氏 菌、鼠伤寒沙门氏菌16SrRNA 、23SrRNA基因的克隆 技术路线： 提总DNA 扩增16SrDNA 23SrDNA pMD18-T 筛选克隆质粒 { 双