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细菌耐药机制研究进展 浙江大学医学院附属第一医院 俞云松 一、外膜孔蛋白减少或丢失 细胞内抗生素浓度降低 膜孔蛋白(OprD): 产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株 PCR扩增Omp36全长及序列分析 插入序列引起OprD2缺失（铜绿） ESBLs的分类 根据基因同源性不同分为： TEM型 80 SHV型 46 CTX-M型 37 OXA型 18 其它型 20 32家医院 1994-2003年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率 头孢菌素酶 大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的AmpC酶。 天然来源碳青霉烯酶 嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶 获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类） B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1 A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等 D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54 金属酶 染色体编码的金属酶：BC Ⅱ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。 获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可转移的基因元件上，造成区域性传播。 IMP型金属酶 IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之间的序列表明：IMP型金属酶大致可以分为两组： 1）IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20 中国 IMP-4 2001年香港 鲍曼 2001年广州 杨格枸橼酸杆菌 、铜绿 IMP-1 2004年12月 江苏无锡 铜绿 IMP-8 2001 台湾 铜绿 VIM型金属酶 VIM型金属酶 与IMP类金属酶同源性?40％，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。 目前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间的序列可将VIM金属酶大致分为三组： 1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b 3）VIM-7 VIM型金属酶分布 VIM-1 1999年 意大利 铜绿 氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单胞 2003－2004希腊 大肠 肺克 法国 肺克 VIM-2 2000 法国 铜绿 意大利 希腊 日本 韩国 葡萄牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国 中国 VIM-3 2001年 台湾地区 铜绿 VIM-4 2002年 希腊 铜绿 2003 瑞典 铜绿 2004 意大利 肺克 阴沟 2004 波兰 铜绿 VIM型金属酶分布 VIM-5 2004 土耳其 肺克 铜绿 VIM-6 2004 新加坡 恶臭假单胞 VIM-7 2004 美国 铜绿 VIM-8 哥伦比亚 铜绿 VIM-9，10 英国 VIM-11 阿根廷 意大利 VIM-2基因整合子结构图 A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 结构同In72 B： S5， S9， S10， S11， S12 （S15、H22除外） H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker Schematic representation of the cloned E.coRⅠfragment 转化试验 抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒 转化DH5α，在含1?g/ml的亚胺培南的MH平板上筛选 成功筛选到亚胺培南耐药的转化菌（转化质粒约60kb） PCR PCR筛选β内酰胺酶耐药基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM 、 OXA-10和KPC-1 以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC 转化菌和克隆菌只有KPC阳性 PCR产物测序分别为TEM-1、SHV-12和KPC-2 转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆） 克隆片段测序 对重组质粒的插入片段进行步移测序，获得1554bp核苷酸 DNAssist软件分析，1个开放读码框(ORF) 经GenBank Blast程序分析，该ORF与KPC-2 (?GenBank注册号:AY210886) 的核苷酸序列同源性为100% blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要的碳青霉烯酶，ISAba1与OXA基因的表达和转移密切相关 氨基糖苷类钝化酶分为： 磷酸转移酶（APH） 乙酰转移酶（AAC） 核苷转