绿色荧光蛋白(GFP)基因的隆、表达和粗提取.docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT1 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘 要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。 方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。 结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白 基因克隆 重组表达 转化 粗提取 目录 TOC \o 1-3 \h \z \u HYPERLINK \l _Toc423258258 1 前言 PAGEREF _Toc423258258 \h 3 HYPERLINK \l _Toc423258259 2 实验目的 PAGEREF _Toc423258259 \h 4 HYPERLINK \l _Toc423258260 3 实验设备 PAGEREF _Toc423258260 \h 4 HYPERLINK \l _Toc423258261 4 材料及试剂 PAGEREF _Toc423258261 \h 5 HYPERLINK \l _Toc423258262 5 实验操作步骤 PAGEREF _Toc423258262 \h 5 HYPERLINK \l _Toc423258263 5.1 操作流程 PAGEREF _Toc423258263 \h 5 HYPERLINK \l _Toc423258264 5.2 质粒DNA的分离与纯化 PAGEREF _Toc423258264 \h 6 HYPERLINK \l _Toc423258265 5.2.1 质粒的培养 PAGEREF _Toc423258265 \h 6 HYPERLINK \l _Toc423258266 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 PAGEREF _Toc423258266 \h 6 HYPERLINK \l _Toc423258267 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 PAGEREF _Toc423258267 \h 7 HYPERLINK \l _Toc423258268 5.3 酶切及连接 PAGEREF _Toc423258268 \h 8 HYPERLINK \l _Toc423258269 5.3.1 双酶切 PAGEREF _Toc423258269 \h 8 HYPERLINK \l _Toc423258270 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） PAGEREF _Toc423258270 \h 8 HYPERLINK \l _Toc423258271 5.3.3 连接 PAGEREF _Toc423258271 \h 9 HYPERLINK \l _Toc423258272 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 PAGEREF _Toc423258272 \h 9 HYPERLINK \l _Toc423258273 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） PAGEREF _Toc423258273 \h 9 HYPERLINK \l _Toc423258274 5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) PAGEREF _Toc423258274 \h 9 HYPERLINK \l _Toc423258275 5.4.3 转化涂板 PAGEREF _Toc423258275 \h 10 HYPERLINK \l _Toc423258276 5.5 GFP蛋白的诱导表达 PAGEREF _Toc423258276 \h 10 HYPERLINK \l _Toc423258277 5.6 绿色荧光蛋白的粗提取 PAGEREF _Toc423258277 \h 11 HYPERLINK \l _Toc423258278 参 考 文 献 PAGEREF _Toc423258278 \h 11 HYPERLINK \l