常见的实验三 对流免疫电泳.ppt

实验三 对流免疫电泳 【实验目的】 掌握对流免疫电泳的原理、操作方法、 结果判定及了解其用途。 【实验原理】 带电胶体颗粒可在电场中定向移动，移动速度及 方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关。蛋白质 为两性电解质，每种蛋白质都有自己的等电点， 在pH值大于其等电点的溶液中，羧基解离多，蛋 白质带负电，向正极泳动；在pH值小于其等电点 的溶液中，氨基解离多，蛋白质带正电，向负极 泳动。pH值离等电点越远，所带电荷越多，泳动 速度也越快。因此，可通过控制溶液的pH值的方 法，使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动，进行抗 原抗体成分的分析，或进行抗原抗体的检测。 电泳缓冲液pH为8.6，在这种溶液中： 抗原分子羧基解离带负电荷，且分子量小，泳动速度快，能克服琼脂中的电渗阻力，故在电泳时从负极向正极移动。 抗体属球蛋白，所暴露的极性基团较少，在碱性缓冲液电离也少，只带微弱的负电荷，且相对分子质量较大，电泳力较小，泳动速度慢，克服不了电渗阻力，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。 将抗体置正极端，抗原置负极端，则电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间相遇，在比例最合适处就会形成白色沉淀线。 免疫电泳的特点： 免疫电泳是由琼脂扩散与电泳结合而成的一种检测技术。抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电场力的作用，使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快，缩短了试验时间；同时限制了扩散移动的方向，使集中朝电泳的方向扩散移动，增加了试验的敏感性，所以该方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。 【实验材料】 1、电泳缓冲液0.05M∕LpH8.6巴比妥缓冲液。 2、抗体 羊抗人的IgG血清。 3、抗原 人的IgG。 4、1％琼脂 用pH8.6巴比妥缓冲液配置， 冰箱保存备用。 5、仪器 电泳仪、电泳槽 6、器械 载玻片、打孔器、10ml吸管、 移液器、移液头。 【实验方法】 1、1.0％琼脂板制备 ① 取pH8.6巴比妥缓冲液100ml置于搪瓷缸 中，加入1g琼脂粉，加热至完全溶解，冰箱保 存备用。 ② 加热熔化1.0％琼脂，待冷却至50～60℃时， 用10mL吸管吸取6mL加于载玻片上。 2、打孔 在凝固后的琼脂板上，用打孔器打两排 孔，孔间距为4mm。 3、加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的 小孔中，抗体加入另一侧小孔中， 以加满为度，不可溢出孔外。 4、电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上， 抗原侧置负极端，抗体孔侧置正极 端。搭好桥后，接通电源，控制电 压6～10 V/cm板长，电泳约30～60 min。 5、关闭电源，取出琼脂板，观察结果。 【实验结果】 将玻片对着光源，观察抗原孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示阳性，否则为阴性。 【注意事项】 电泳时电流不宜过大，以免蛋白变性。 抗原和抗体的电极方向不能搞错。 抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。 琼脂的质量要好（选用进口或者进口分装），否则不易出现结果，也可选用琼脂糖。 琼脂的浓度不宜太高（1％～2％），应以容易挑出孔内琼脂为宜。 【思考题】 1、对流免疫电泳有何特点？ 2、对流免疫电泳中，抗原为何放阴极 端，抗体为何放阳极端？ * * Ab Ag Ab Ag 标记孔 沉淀线