常见的细胞融合的方法、过程和影响因素.ppt

第四章－1 细胞融合 Cell Fusion 细胞融合机理 细胞融合的关键：脂双层的接触靠近, 细胞桥形成, 胞质渗透－细胞核融合。 二、诱发细胞融合的方法 1.病毒促进细胞融合 病毒类融合剂是研究的最早的促融剂，一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但由于毒性大，应用上收到很大限制。 仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。 这一现象对你有何启示？ 2.化学融合剂促进细胞融合 1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促进细胞融合， Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。 PEG是一种多聚化合物，商品名卡波蜡Carbowax,分子量200－20000，靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多种。 聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 原理：PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2＋的连接下，形成静电键，促使异源的细胞膜间的粘着和结合，在高pH,高Ca2＋溶液的作用下，将Ca2＋和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种细胞膜上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 注意事项 1 PEG融合的关键是作用时间 2 PEG规格和纯度与融合效率有关 3 融合与细胞密度有关 4 融合液中加入少量CaCl2，即维持一定电导率，对细胞也有保护作用 注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。 优点： 融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 第二节 融合细胞的筛选 ??? 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 ??? 1）亲本 ??? 2）同核体homokaryon ：同源细胞融合体，它们的基因型和表现型完全一样。 ??? 3）异核体heterokaryon ：异源细胞的融合体，它们含有双亲细胞核和细胞质物质。 ??? 4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 ??? 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。 ??? 6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 动物细胞融合的筛选方式： 1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。 杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。 4 具有所需性状杂种细胞的筛选 HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种: 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。 HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。 含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 第三节 融合细胞克隆化 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。 在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。 方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。 第四节 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用 1）基因定位 不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下