大肠杆菌表达系统(精品·公开课件).ppt

其他表达系统 四、高效表达目标基因的战略和技术 溶氧调控型 采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子，硝基还原酶基 因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子构建表达载 体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子 fnr 的作用位点。 在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。 其他表达系统 溶氧调控型 大肠杆菌 GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表达质粒， vgb 基因的转录是受环境溶氧 浓度调控的，在贫氧条件下 vgb 基因的启动子被激活。 因此，用大肠杆菌GJ100 作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧 诱导型， 菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量 加以调节，与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。 其他表达系统 生物素调控型 用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程 中生物素会不断消耗，当浓度到达 2ng/ml 以下时启动子被激活。 能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的 基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的 时刻。 其他表达系统 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率 终止子 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用 终止子 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 核糖体结合位点 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就 越高，而这种结合程度主要取决于 SD （ UAAGGAGG）序列与 16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。