《72毛细管电泳法-72毛细管电泳法》精选课件.ppt

5 毛细管等电聚焦 CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法。 蛋白质的等电点(pI): 指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。 方法: 进样－等电聚焦－检测 先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦. 在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。 5 毛细管等电聚焦 特点: 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质. 注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定 5 毛细管等电聚焦 6 毛细管电色谱 CEC:以电渗流驱动流动相， 开管和填充两种 比高效液相色谱具有更高的柱效 三 进样与检测 1 进样方法 电动进样 也称电迁移进样. 方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。  1 进样方法 流体动力学进样 也称为虹吸进样、重力进样、压差进样 方法:毛细管进样端插入试样溶液容器，通过进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，使进样口端与出口端形成正压差，并维持一定时间，试样在压差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳  2 检测方法 紫外吸收检测器  2 检测方法 检测器 检出限（mol/L） 特 点 UV－可见吸收 10-5－10-6 近似通用，常规应用 荧光 非相干光诱导 10-7－10-8 灵敏，但试样通常要衍生 激光诱导 10-10－10-12 高灵敏度，价格昂贵，要衍生化 电化学 ? 电导 10-5－10-7 通用性 安培 10-8－10-9 选择性，灵敏度高，微量 质谱 10-7－10-9 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 放射 10-9－10-11 灵敏度高，操作有特殊要求 四 应用 阵列毛细管凝胶电泳分析DNA序列 硬件由十六条毛细管组成阵列 用氩激光激发荧光检测 CCD检测器接收荧光 可以进行连续地大规模地基因测量 * 分析化学 分析化学 * 毛细管电泳法Capillary Electrophoresis, CE 毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。 20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖 1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。 上一世纪后二十多年分析化