常见的细胞的传代培养和细胞计数法.ppt

* * 细胞传代培养及细胞计数 人癌细胞系传代培养 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液； 4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液, 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。 注意事项 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。 血球计数板法 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过多时需适当稀释,单个细胞率95%。 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）×104×稀释倍数 细胞活力测定－台盼蓝染色法 制备单个细胞悬液：105～106／ml 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100 细胞密度调整 稀释公式：C1·V1＝C2·V2 稀释前细胞密度C1，溶液体积V1 稀释后细胞密度C2，溶液体积V2 细胞计数 106/ml Cell susspension 105/ml 104/ml 103/ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml Medium 0.9ml 细胞生长曲线测定－计数法 DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo) 培养细胞的纯化方法 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷 细胞培养过程中常见的问题 培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染 细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，支原体污染 ，缺乏附着因子 细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积 细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培养细胞衰老 ，支原体污染