《11A复制徐晋麟分子生物学》精选课件.ppt

第十一章 DNA的复制 第一节 半保留复制的验证 半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。 验证半保留复制的实验 一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining） 5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR） 斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型—θ型复制  图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。 第二节 复制的起点、方向和终点 一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法 2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法（denaturation mapping） 4. 双向电泳法 图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多 二、原核的复制起点和方向 E.coli定点、双向对称复制。 T7在近一端的17％处开始，向两端延伸。 枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。 质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组 进行时双向复制。 质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。 mt DNA进行D（displaced loop）环复制? 真核有多个复制起点（i），双向等速复制。 D环复制 第三节 DNA复制突变型的筛选 根据温度敏感性筛选 同位素标记法筛选 5－溴尿嘧啶掺入法 质粒温度敏感性的筛选 根据抗药性筛选 根据与突变有关的生物学功能筛选 快停突变与慢停突变 第四节 原核生物复制的酶系统 DNA合成酶DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引 物提供3－OH； （3）合成的方向都是5‘→3’ （4）除聚合DNA外还有其它功能。 表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶 (一). DNA聚合酶I的结构 DNA聚合酶有6个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (3) 引物3‘－OH结合位点； (4) 底物dNTP结合位点； (5) 5‘→3’外切酶结合位点； (6) 3→5校正位点。 (二). DNA聚合酶Ⅰ的功能 1. 5‘→3’聚合功能 2. 3‘→5’外切活性 3. 5‘→3’外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性 (三)DNA多聚酶Ⅲ的结构 全酶在DNA上的装配分为三个阶段： （1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引 物模板形成一种前起始复合物。 （2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象 发生改变，而对核心酶产生了高亲和。 使核心酶能与DNA结合。 （3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。 二. DNA连接酶 其作用机制是分三步进行： 1、E＋ATP→E－AMP＋ppi 在E.coli中， E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸） 2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使其活化 3、活化的5‘－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’ 磷酸二酯键，并释放出AMP。 三. 单链结合蛋白 又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein） 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚存在 分子量为74KDa 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。 （1）SSB之间的相互作用； （2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。 四.解旋酶(helicase) 第五节原核生物，噬菌体和病毒的复制起 始和终止 一.环状DNA的复制 复制起始区的结构特点是： （1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始 复制有关； （2）含有多个回文结构（9－14个GATC） 8个GAT