常见的限制性内切酶原理.ppt

为什么通常要用两种限制酶？ 可以有效防止载体自连造成空载体。 连接酶 可不可以用一种酶切割目的基因和载体？ 可以，此时切割后的载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶可以去除酶切后切口的磷酸，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。 ? 5’NNNGC-OH p-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-p HO-CGNNN5 ‘ 5’NNNGC -OH GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG HO-CGNNN5 ‘ 碱性磷酸酯酶 单酶切法 ? pAGCTTNN ? ? ? NNA-OH HO-ANN ? ? ? NNTTCGAp DNA连接酶 基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么办？ Hsp70A ：Ex-F 5 CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3 Nde I Hsp70A ：Ex-R 5 GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3 Not I 通常是设计合适的PCR引物，让目的基因在PCR扩增后，两侧含有酶切位点。 DNA甲基化酶 4 甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。 原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ等）的识别位点中含 GATC 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如 BamHⅠ、Sau3AⅠ等。 甲基化酶对限制酶的影响： 1.修饰酶切位点。 构建 DNA 文库时，用 AluⅠ（AG↓CT） 和 HaeⅢ（GG↓CC） 部分消化基因组 DNA 后，将得到的片段用 M.EcoRⅠ甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoRⅠ 接头，再用 EcoRⅠ来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。 2.产生新的酶切位点 有些酶只识别经过甲基化的序列。DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。 * II型限制酶 限制酶的定义 1 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。 限制酶的发现 命名 EcoR I Escherichia 属名 Coli 种名 Ry13 株系 编号 切割频率 切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。 前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。 如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。 限制酶的种类 2 I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。 II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 III型限