生物工程下游技第十五章_目标产品的蛋白质分析检测与质量控制.pptVIP

第十五章 目标产品的蛋白质分析检测技术及质量控制 基因工程产品的鉴定 美国食品与药品管理局的要求： 分子量,溶解度,等电点,氨基酸序列,肽谱,二硫键配对,糖脂电泳图谱,二级结构,三级结构,与内源性物质的关系,受体的分布和结合等。 一、蛋白质含量和纯度 含量:mg/ml, mg/g材料 纯度:每单位重量样品中目标蛋白质占总蛋白的比例.是一个相对指标,可用百分比表示.一般指是否含有杂蛋白,而不包括是否含有盐、离子等小分子的物质。纯度等级可分为95%，99%和99.9%等。 蛋白质含量和纯度测定方法 含量测定:凯氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚法、紫外线法和考马斯亮兰法（Bradford法）。 纯度衡量:电泳法、层析法、质谱法等。 一般应采用二种以上方法鉴定纯度，而且同一原理的方法不应该采用二次。 五种蛋白质测定方法比较 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法 灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100?g 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法 灵敏度高 ～5?g 慢速 40～60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法 灵敏度最高 1～5?g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其?max由465nm变为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 氨基酸分析 柱后反应法：将游离氨基酸经过色谱柱分离后，氨基酸再与显示剂（茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛）作用。 柱前衍生法：将各种氨基酸和荧光试剂先生成氨基酸衍生物，然后再用柱把各种衍生物分开。 蛋白质的分子量测定 超离心法 光散射方法 凝胶过滤法（测完整蛋白质分子） SDS电泳法（测亚基） 较新的方法：毛细管电泳、质谱 等电聚焦法 测定蛋白质的等电点 鉴定蛋白质的纯度 肽谱 指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。 蛋白质突变点分析 天然蛋白质和突变蛋白质肽谱的比较 荧光标记Cys; 同位素标记法； 紫外吸收法 二硫键分析 同位素标记 化学修饰 直接分析二硫键的异构物 质谱定位二硫键 蛋白质的序列测定 测定蛋白质的一级结构方法： 蛋白质化学法：（Edman降解法测定N端和羧肽酶或化学法测定C端） cDNA演译法 质谱法 二维核磁共振 试分析影响蛋白质在电场中行为的主要因素? 什么叫蛋白纯度?如何测量蛋白质纯度? 选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 * 蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 * * 选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 * 蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 * *