苎麻木质纤维高效降解菌分离与鉴定.doc

苎麻木质纤维高效降解菌的分离与鉴定-农学论文 苎麻木质纤维高效降解菌的分离与鉴定 王超群，陈洪高，张运鹏 （武汉纺织大学环境工程学院，武汉４３０２００） 摘要： 利用羧甲基纤维素钠培养基，从腐烂苎麻秆堆中分离到１株高效纤维降解细菌，形态学观察结合１６Ｓ ｒＲＮＡ基因分子鉴定。结果表明，该菌属于蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ），发酵进行产酶的最适温度和ｐＨ分别为４２ ℃和７．０，在该条件下，于１００ ｍＬ发酵体系中发酵降解苎麻纤维，发酵９６ ｈ 后纤维素酶活力达到最高值２４．３ Ｕ／ｍＬ，发酵８ ｄ后其纤维降解率为45.1%。 关键词 ：苎麻纤维；纤维素酶；１６Ｓ ｒＲＮＡ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ 中图分类号：Ｓ５６３．１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０3－0565－０4 随着石油资源的日益枯竭、全球能量的需求持续增长和城市空气污染的日益严峻，可再生燃料和燃烧后释放温室气体较少的生物燃料正在成为化石燃料的理想替代品。纤维素是地球上最丰富的可再生有机物资源和重要的生物能源原料。芒草、麻类作物、作物秸秆和木材废料等都含有丰富的纤维素成分［１］，作为第二代生物能源技术，欧美各国正在将纤维资源利用重点研发［２］。 纤维素酶（CMC）是实现纤维素降解的关键酶，只有纤维水解成了可溶性糖，才能被微生物发酵转化成生物能源［３］。由于真菌纤维素酶不如细菌纤维素酶那么复杂，容易分离纯化，目前主要用真菌来生产纤维素酶，如木霉、曲霉、青霉、根霉和漆斑霉等［４］。然而，细菌纤维素酶也具有其独特的优势，如：细菌生长较快，比真菌更容易重组出较高产率的纤维素酶；细菌纤维素酶虽然复杂但同时也赋予其更多功能，在降解纤维时能够很好地协作；细菌纤维素酶比真菌纤维素酶更能适应酸、碱、热、盐等极端环境，具有更广泛的工业应用前景。因此，细菌纤维素酶最近正受到越来越广泛的关注［５］。研究较多的产纤维素酶细菌主要有Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｒｅｍｏｃｅｌｌｕｍ和Ｐｓｅｕｄ-ｏｎｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，关于Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ降解纤维的报道并不多见。 本研究从腐烂苎麻秆堆中筛选出１株高效降解苎麻纤维的微生物，优化其发酵条件，研究其产酶特征，鉴定其种属，为苎麻生物量的高效利用探索途径。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１微生物从咸宁湖北新农生态麻业有限公司园区一个长期露天堆置的苎麻秆堆中收集正在腐烂麻秆残渣约２００ ｇ，立即带回实验室用５００ ｍＬ无菌水浸洗，然后用双层纱布过滤去除残渣，滤液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清液作为菌源备用。 １．１．２培养基富集培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５ ｇ／Ｌ，K２ＨＰＯ４ １ ｇ／Ｌ， Ｎａ２ＣＯ３ ５ ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１５ ｇ／Ｌ，酵母浸出粉１０ ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。 ＣＭＣ－Ｎａ分离培养基：羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）１５ｇ／Ｌ，酵母膏０．２ ｇ／Ｌ，KＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ， ＮＨ４ＮＯ３ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ／Ｌ，琼脂２０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。 ＣＭＣ－Ｎａ筛选培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５ ｇ／Ｌ，KＨ２ＰＯ４ １ ｇ／Ｌ， ＮＨ４ＮＯ３ １ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ／Ｌ，琼脂２０ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。培养４ ｄ后用刚果红进行染色鉴定。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏３ ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ ｇ／Ｌ。 ＣＭＣ－Ｎａ发酵培养基：酵母膏０．２ ｇ／Ｌ，蛋白胨３ ｇ／Ｌ，ＣＭＣ－Ｎａ １０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２ ｇ／Ｌ， KＨ２ＰＯ４ ４ ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／Ｌ， ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ／Ｌ， ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。 苎麻纤维发酵培养基：苎麻纤维２０ ｇ／Ｌ，酵母膏 ４ ｇ／Ｌ，ＮＨ４ＮＯ３ ４ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ／Ｌ， KＨ２ＰＯ４ ４ ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。（将除苎麻纤维之外的部分配成溶液储存，灭菌的苎麻纤维临用时加入。） １．２方法 １．２．１富集培养取２０ ｍＬ菌原液接种到８０ ｍＬ富集培养基中，４２ ℃恒温培养４ ｄ。 １．２．２初筛取富集培养液稀释成１０－３、１０－４、１０－５，涂布于ＣＭＣ－Ｎａ固体培养基，每个稀释梯度涂布３个平板，４２ ℃恒温培养至长出菌落，然后在相同的