《第五章、单倍体的产生》.pptVIP

第五章、单倍体的产生 所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。单倍体在遗传研究和植物育种中的意义在于： 1．在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。 2．在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。 一、花药培养的一般程序 1.取材 花药在接种之前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好，在烟草中，此时花蕾大约与萼片等长，水稻颖片通常达到最后大小，颜色淡绿，颖内的花药色亦淡绿。 2 .预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草 7～9℃，7～14 d；水稻7～10℃，10～15 d；黑麦l～ 3℃，7～ 14d；大麦 3～ 7℃，7～ 14 d 3.消毒 花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。 4. 接种 在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。 在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。 不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。 由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。 5 .培养方式和培养条件 花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入3 0％Ficoll的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。 花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d给以30～32℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在 17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。 对光照的要求在物种间差异更为明显，例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。 愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养，须待3～5 d后再给以每天 14 h1000 ～2 000lx的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。 6 花粉植株的诱导 烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚—心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达180株以上（图 7．2） 禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。首先，第一步，将花药接种在含有 2，4－D（1～2 mg／L）的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。 然后，第二步，当花粉愈伤组织形成10～15 d，其直径已长到 1．5～2．0mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化 。分化培养基中不含 2，4－D，含有 NAA和 KT各0.5mg／L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根（图7．2） 在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整