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贴壁细胞 贴壁细胞 贴壁细胞 无菌技术 每人准备一套实验材料（器皿、溶液等），不可混用。 无菌的思想贯穿到细胞培养的任何操作步骤。 概念——“代” 细胞分裂一次？ 错！ 培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。 传代培养的要诀（一） 该出手时就出手！ 该换液时就要换液，该传代时就要传代！ 否则，细胞就不是那个细胞 细胞会衰退、分化、生长缓慢…………，多数情况下很难扭转和补救。 传代培养的要诀（二） 勤观察 每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊 观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并不大，表明有污染的可能性。 镜下观察细胞形态、生长速度。 观察培养箱水盘中的水是否干净。 观察CO2压力表。 观察液氮罐内液氮体积 传代培养的要诀（三） 严格无菌操作 轻柔：避免机械力损伤细胞，重悬细胞时尽量用50ml离心管，通过晃动离心管分散细胞，尽量避免过力吹打。离心力不可超过300g（普通台式离心机水平转子1000rpm）。 快速：防止因过分小心导致操作时间过长，增加污染概率。 每代贴附生长细胞的生长过程  每代贴附生长细胞的生长过程 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时 贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞进入平台期。 何时传代？ 贴壁生长细胞传代方法（一） 国内广泛使用的方法。 缺点： 1. 消化时，瓶内液体较多，液体振荡的机械力会使细胞成片脱落，难以形成单细胞悬液。 2. 培养基消耗较多。 3. 耗时长。 4. 须将细胞液移入离心管操作，增大污染的概率。 5. 两次吹打，对细胞机械损伤较大。 贴壁生长细胞传代方法（二） 传代步骤 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料： 2.1. PBS, 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水槽回温 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 吸掉旧培养液。 3.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 细胞传代，什么最难？ 做一件好事不难，难的是做一辈子好事。 传一两代细胞不难，难的是持续稳定的传十几代、几十代细胞，难的是持续稳定的传几个月、几年细胞。 材料准备、溶液配制、无菌操作、培养条件、传代时机、传代频率、消化程度、吹打力度、接种密度…… 均要正确而稳定。 建 议 正式开始实验前，练习细胞传代培养 至少2个月。 电子细胞计数器 生长曲线的绘制 生长曲线的绘制方法（略） 取样均匀。 多次测量取平均值。 生长曲线的分析 重要参数 1. 潜伏期时间 2. 倍增时间 3. 平台期密度 生长曲线的分析 生长曲线的分析 细胞冻存和复苏过程中，对细胞最大伤害的是细胞内水形成的冰晶。所以最重要的就是要减少冰晶的形成。 1. 慢冻快融 2. 加入细胞保护剂（DMSO、甘油等） 细胞保护剂——DMSO 使用浓度：5％～10％，一般用10％。 复苏时需1:20稀释，从10％稀释到0.5％。 如果进出细胞速度过快