糖类消化酶性的测定方法及原理.pptxVIP

糖类消化酶活性的测定方法及原理（以淀粉酶为例） 资料查找：林俊凤、罗雨涵、刘恺妍 ppt制作：何叶 演讲者：杨麒麟 指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下酶促反应速度来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 淀粉酶的定义及分类： 酶活性的定义： 1、在最适温度之前，淀粉酶的活性随着温度的升高而升高，达到最适温度之后，淀粉酶的活性随着温度的升高而降低至失活。 2、淀粉水解反应：淀粉 蓝糊精－紫糊精－红糊精－无色糊精－麦芽糖 遇碘呈现颜色：蓝色－ 蓝色－紫色－红色 － 无色－无色 课本提要 实验原理： 测定α-淀粉酶活性的常用方法有：3 ,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）、凝胶扩散法、和降落值法 目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法 。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。 3 ,5-二硝基水杨酸比色法 α-淀粉酶：耐热不耐酸，70℃加热15min仍保持活性，pH3.6时钝化； β-淀粉酶：耐酸不耐热，70℃加热15min即钝化 本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α-淀粉酶的活性。具体方法：利用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成麦芽糖的含量，以单位时间内淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性大小，再与非钝化条件下的（α＋β）总活性进行加减运算得到另一个淀粉酶的活性 （1）实验原理 （2）实验材料 淀粉酶液50ML、恒温水浴锅、刻度试管、0.4mol的NaOH、1%淀粉、3,5-二硝基水杨酸、麦芽糖标准溶液（1mg/ml）、0.1molpH=5.6的柠檬酸缓冲液 ①以1号管为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度，以麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，A540nm为纵坐标，用Excel绘制标准曲线 ②取两只试管一只对照，一只测定——各加淀粉酶原液1ml——70℃加热15min——冷却——向对照管加4ml0.4mol的NaOH，终止酶活性。 ③向各管中各加入柠檬酸缓冲液1mL。 ④将测定管与对照管于40℃中加热15min——各加入2mL40℃预热的淀粉溶液——将2管混合均匀后立即用40℃水浴5min——取出后迅速向测定管加入4mLo0.4mol的NaOH ⑤取对照管和测定管中的溶液各2ml，分别加入刻度试管中——分别向两只试管加入2ml3,5-二硝基水杨酸——沸水浴5min——冷却——稀释至20mL——混匀——以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调零，测定540nm处吸光度——记录结果 （3）实验操作 通过标准曲线获得相应的麦芽糖含量（mg/ml） 按下列公式计算淀粉酶活性 α-淀粉酶活性=(A2-A1)*V*D/W 其中：A1为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml） A2为测定管中α-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml） V为酶促反应体积 D为酶液总体积 W为样品鲜重 （α＋β）淀粉酶总活力=（B2-B1）*V*D/样品鲜重 其中：B2为(α＋β)淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml） B1为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml） V为酶促反应体积 D为酶液总体积 β酶活性=(α＋β)酶活性-α酶活性 4 实验结果计算 THANK YOU