《实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定 》.ppt

实验十四 酵母蔗糖酶 分离、 纯化、活力测定、电泳检测 蔗糖酶的提取纯化 一、实验目的和要求： 了解离子交换层析的基本原理。 掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。 熟悉有关生化技术的操作方法。 二、实验原理 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1 mol 蔗糖，就生成2 mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，如Nelson 比色法、斐林试剂法等。 本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶（invertase），并对其性质进行测定。 采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，由此即可得蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离纯化过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 三、实验的主要材料 市售干酵母粉 四、实验的主要试剂 1、石英砂（助研磨作用）。 2、 95％乙醇（沉淀杂蛋白）。 3.、 DEAE—Sepharose FF(弱碱性阴离子交换剂，用于蛋白质分离)。 4、 20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液（简称buff，用以维持蔗糖酶 液的最适pH。） 5、 0.5 mol/L NaCl （调节溶液离子强度）。 6、3，5-二硝基水杨酸试剂（作为还原糖显色剂）。 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。 五、实验的主要仪器 1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm) 六、实验操作流程 干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF柱→层析→活力检测 七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处理一步外，尽可能低温） 第一部分 样品的制备： 1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管，12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积，留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测定酶活力和蛋白浓度。 2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。 3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！）放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管5000rpm离心10min，待上样。 第二部分 DEAE-Sepharose FF柱层析 DEAE—Sepharose FF处理:（ 按说明书处理） 取适量DEAE- Sepharose Fast F