《分子细胞生物学——细胞生物学研究技术》.ppt

速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒(细胞器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 速度沉降 等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。 细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞器分离。 等密度沉降 二、层析分离技术 层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。 ①凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) ②离子交换层析(ion-exchange chromatography) ③亲和层析(affinity chromatography) 凝胶过滤层析 又称排阻层析或分子筛过滤，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化的一种方法。 原理：蛋白质的体积大小不一，凝胶上有大小不一的孔；大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢，小的蛋白质则进入小孔中，下来速度最慢。 离子交换层析 离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。 它以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。????????????? 在生物分子中，有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可使这种结合解除，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法 亲和层析 一、离心分选术 二、流式细胞分选术 三、免疫磁珠分选术 四、电泳分选术　 第四节 细胞分选技术 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。 包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计(仪) (flow cytometer)。 二、流式细胞术 三、免疫磁珠法 磁珠可以结合蛋白质，也可以被磁铁吸引而发生力学移动。将微小磁珠用抗体(或抗原)包被后，使之与溶液中目的细胞表面的抗原(或抗体)特异性结合，再通过磁力作用发生力学移动，从而达到目的细胞与其他细胞(或物质)分离。 四、细胞电泳 在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳 (cell electrophoresis)。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，可用来分离不同种类的细胞。 所谓细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学的方法，对细胞进行操作。 第五节 细胞工程技术 细胞工程基本技术主要包括：细胞体外培养、细胞融合、细胞器移植及基因转移等。 一、细胞体外培养技术 二、细胞融合及单抗技术 三、显微操作技术 四、干细胞技术 　 将离体细胞或组织放置在适当的环境条件下进行培养，使其能生长并增殖的一种技术。 用于检测各种理化因子、细胞因子等对细胞形态结构、增殖、分化、代谢、运动、吞噬、分泌等生命活动的影响，还可用于研究细胞癌变及逆转的机制，也可用于获取特定的细胞、细胞产物等等。 一、细胞培养技术 二、细胞融合技术 通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交。相同基因型细胞融合成同核体(homokaryon)；不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。 动物细胞融合有以下三条途径： 1. 病毒诱导融合； 2. 化学诱导融合； 3. 电激诱导融合。 单克隆抗体技术 单克隆抗体(monoclone antibody)