Nrf2ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制.doc

Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制 田戈姜敏通讯 新疆医科大学附属屮医医院国家屮医临床研究基地新疆乌鲁木齐 830000 】目的：研宄Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探 讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程屮的作用机制。方法： 80只小鼠随机分成4组，分别熏烟2个月、四个月和6个月，应用Fenton反应， ELISA, Real-time PCR等方法检测抑制羟自由基能力、Nrf2、GSH、蛋白及Nrf2、 gamma;-GCS mRNA的表达，并行相关分析。结果：Fenton反应结果品示抑制释 自由基能力在6个月熏烟组显著高于正常组(Plt;0.05)； ELISA结果显示熏烟各 组血清屮GSH含量均高于对照组，其屮熏烟4个月GSH含量与对照组相比差异 显著(Plt;0.05),熏烟6个月GSH含量与对照组相比差异极显著(Plt;0.01)； Real-time PCR结果显示熏烟各组gamma;-GCS mRNA转求水平都高于正常组，其 屮熏烟6个月组gamma;-GCS mRNA水平昆著高于对照组(Plt;0.01);而Nrf2蛋 闩及mRNA在各组表达无明显差异(Pgt;0.05;结论：过氧化物在熏烟各组小鼠 肺组织屮累积，AT能通过活化Nrf2，促进Nrf2核积聚上调gamma;-GCS的基因 表达，在氧化失衡屮发挥作用。 关键词】慢性阻塞性肺病，氧化应激，Nrf2-ARE信号通路，gamma;-谷 氨酰半胱氨酸合酶 屮图分类号】R34 】B 】1674-8999 (2015) 8-0187-02 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种可预 防、可治疗的疾病，以不完全可逆的气流受限为特点，呈进行性加重［1］。COPD 发病机制尚未完全清楚，目前研究主要集屮在慢性炎症反应、蛋內酶/抗蛋白酶 失衡、氧化应激和上皮细胞凋亡等方面[2,3],氧化应激是造成COPD慢性全身 损伤的重要原因。Nrf2-ARE防御性信号通路在抵抗内外界氧化应激反应，维持体 内环境的稳定方面起到十分重要的作用。 本实验拟通过香烟烟雾吸入法建立COPD的小鼠模型，并检测造模不冋吋间 段Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探讨Nrf2-ARE信号通路在调 节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制。 1材料与方法 1.1药物及试剂 Elisa试剂盒均购置于武汉优尔生科技冇限公司，Mouse Nrf2 ELISA Kit, 1 Plate （货号 SEL947HU）; Mouse GSH ELISA Kit, 1 Plate （货号 CEA294Ge）。 1.2实验动物及模型建立 清洁级雄性玷明小鼠80只，6?8周龄，质量18?20g,由新疆维吾尔自治区 疾病控制中心提供。应用数字表法将动物随机分为正常组、熏烟2月组、熏烟4 月组、熏烟6月组，每组20只。除正常组外，其余各组均使用自制熏烟箱进行 熏烟，12支香烟/次，1日1次，每次lh，分别持续2, 4, 6个月，造模结束。 因本实验完全复制前期COPD小鼠造模过程ii没有药物干预，所以死亡率很低, 能确保实验顺利完成，造模结束后各组小鼠均为12只以上，符合统计要求。 1.3标本采集和处理 1.3.1肺组织匀浆收集：然后处死大鼠，取右肺50mg加入ImL冷生理盐水 做肺组织匀浆，lOOOOrpm离心lOmin,上清液于-80°C冰箱保存； 1.3.2血清收集：各组小鼠腹腔注射10%的水合氯醛0.3mL/100g以麻醉。 麻醉后将小鼠仰面固定于手术台，75%酒精消毒皮肤后，打幵腹腔，使用一次性 真空采血针行腹主动脉采血，采血针另一端连接非抗凝负压采血管，找到腹部动 脉血管抽取小鼠动脉血于采血管内，37°C静置30min, 3000rpm离心10分钟收 集血清，分装后标记，-80°C保存备用。 1.4测定肺组织匀浆中羟自由基OH- 严格接照Fenton反应试剂盒说明书操作步骤进行羟自由基含量的测定。预 实验确定肺组织匀浆合适的稀释浓度5%,反应后通过gress试剂显色，生成红色 物质，lcm光径，550nm测吸光度值，计算公式为抑制释自由基能力（U/mgprot） =对照管吸光度-测定管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度标准管浓度 divide;（蛋白毫克数/mltimes;取样量） 1.5肺组织总RNA的提取及反转录 将100 mg肺组织于液氮中研磨，在液氮挥发完全前用DEPC处理过的不锈钢 钥匙把粉状物转加入于ImL的Trizol裂解液中，并振荡混匀；然后样品置于离心 机中4°C、10000 r/min离心10 min；将上清转