《第十章核酸分子杂交技术》-课件.ppt

一、DNA变性与复性 第三节 探针的标记 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA 三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量 四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定 2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： （2）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落 （3）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察 （4）杂交 杂交液体积小：10~20μl cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50 ℃ （5）杂交结果检测 所用探针为核素标记,放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测 五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。 （一）RNA酶保护分析法 1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。 2、杂交过程 制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记RNA探针 杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交 RNaseA和RNaseTI除去单链RNA 电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果 （二）核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法 2、杂交过程 制备待测RNA：总RNA或mRNA均可 单链DNA探针的制备与标记 杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交 核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA 电泳分离DNA/RNA杂交体分子 放射自显影检测杂交结果 一、探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 二、标记物 （一）理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性 (二) 标记物种类 核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光 三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中