金莲花初代培养剖析.doc

金莲花初代培养剖析 　　摘要：为了探讨不同因素对金莲花初代培养的影响，最终筛选金莲花初代培养的最适外植体、灭菌处理及诱导或分化培养基，为金莲花离体快繁和规模化、工厂化育苗提供理论依据。以金莲花叶片、叶柄、根颈和根为外植体，以乙醇和HgCl2为灭菌剂，以MS为基本培养基，通过不同浓度的6-BA和NAA配比，进行金莲花初代组织培养研究。结果显示，叶柄是金莲花再生初代培养的最佳外植体，其通过愈伤组织诱导途径建立再生体系，最佳的灭菌组合是75%乙醇灭菌10 s+0.1% HgCl2 灭菌4min，最适培养基为MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；其次是根颈，以不定芽分化途径为主，最佳灭菌组合为75%乙醇灭菌20 s+0.1% HgCl2 灭菌6 min，最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。 　　关键词：金莲花；初代培养；灭菌处理；叶柄；根颈不定芽；愈伤组织；诱导培养基；工厂化育苗 　　中图分类号： S682.19文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2016）08-0066-03 　　金莲花（Trollius chinensis Bunge）属毛茛科（Ranunculaceae）金莲花属（Trollius），别称“金芙蓉”“金梅草”“旱莲花”等，是稀有野生药用植物，喜湿喜凉，多生长在海拔1 800～2 700 m 的疏林或山地，集中分布在河北、山西、内蒙和东北等地，其中以河北承德地区所产金莲花药材质量最佳[1-5]。近年来，人们逐渐认识到金莲花的药用价值和观赏价值，对其大量采摘，再加上旅游、开荒、放牧等行为，金莲花野生资源及其生境遭到了极大的破坏，价格逐年上涨。因此，对金莲花进行引种驯化和人工栽培具有非常重要的意义。目前，金莲花的人工栽培方法常见种子直播法和幼苗移栽法[6]。杨玉芳等采取实生播种进行金莲花幼苗培育，结果发现金莲花幼苗死亡率很高，且幼苗苗期栽培管理困难，难以达到迅速培育优质种苗的目的[7]，而组织培养技术可以在短时间内培育大量优质种苗[8-9]。本试验对金莲花的初代培养进行详细的探索，以期为金莲花的工厂化育苗、次生代谢物生产等提供理论及技术依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　随机选取在温室播种的金莲花幼苗（苗期3个月），种子购自河北承德。 　　1.2试验时间及地点 　　试验于2015年1―5月在河北北方学院组织培养实验室进行。 　　1.3试验方法 　　1.3.1金莲花初代培养外植体的筛选将金莲花幼苗从温室取回，用清水冲洗干净根部基质后置于流水中冲洗2 h，再用洗衣粉水浸泡30 min，接着用流水冲洗4 h，将金莲花幼苗分成叶片、叶柄、根颈和根4个部分，先用75%乙醇表面消毒 10 s，再用0.1% HgCl2灭菌6 min，无菌水冲洗干净，接种于MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的培养基上。 　　1.3.2灭菌剂及处理时间对金莲花叶柄和根颈初代培养的影响外植体筛选出来的叶柄和根颈经过清洗处理后，分别置于无菌瓶中，用75%乙醇和0.1% HgCl2的不同组合进行外植体表面灭菌，筛选最佳的灭菌处理时间组合。 　　1.3.3培养基组成对金莲花叶柄和根颈初代培养的影?以MS为基本培养基，在此基础上添加不同浓度的6-BA和NAA，筛选叶柄愈伤组织诱导和根颈分化的最适培养基。 　　1.3.4培养基的制备和培养条件基本培养基中添加蔗糖30 g/L、琼脂3.5 g/L，于121 ℃高温灭菌20 min，灭菌前pH值调至5.8，培养室温度控制在（25±2） ℃，光照14 h/d。 　　1.4试验数据统计分析 　　接种1周后统计污染率，2周后统计死亡率、成活率、愈伤组织诱导率和不定芽分化率等，记录数据的同时观察外植体生长状况并拍照。污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%；成活率=成活外植体数/接种外植体数×100%；死亡率=死亡外植体数/接种外植体数×100%；愈伤组织诱导率=诱导愈伤组织外植体数/成活外植体数×100%；分化率=分化根颈数/成活根颈数×100%。 　　所得数据采用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计、方差分析和多重比较（Duncans法）。 　　2结果与分析 　　2.1不同外植体的初代培养情况 　　将处理过的金莲花幼苗分成叶片、叶柄、根颈和根4个部分，分别接种在MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA上，观察其各自的变化情况。1周后，叶片有13.33%被污染，5000%死亡，只有16.67%有愈伤组织形成，且愈伤组织相对较多（图1），其余的20%无生长表现，死亡叶片最初表现为颜色逐渐变黑，而后死亡；叶柄的污染率和死亡率与叶片相比相对较低，分别只