代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻-生物化工专业论文.docx

To elevate the acetoin productivity of the engineered strain CGL4, fermentation was carried out in rich medium puls 65 g glucose/L at 150 rpm. Strain CGL4 generated 22.44 g/L acetoin. Acetoin reached 70.5% of the theoretical yield and acetoin productivity was improved to 0.44 g/(h L). The productivity of acetion improved by 1.16 fold compared with minimal medium. These results demonstrate that acetoin production by C. glutamicum ATCC 13032 could be successfully achieved by metabolic engineering, providing some valuable information for other studies. KEY WORDS：Acetoin, Corynebacterium glutamicum, Metabolic engineering, Acetolactate decarboxylase, Acetolactate synthase 目 录 第一章 文献综述 1 1.1 乙偶姻的性质及应用 1 1.2 乙偶姻的合成 1 1.2.1 化学合成法 2 1.2.2 生物转化法 2 1.3 乙偶姻相关代谢过程 3 1.3.1 乙偶姻合成代谢 3 1.3.2 乙偶姻和 2,3-丁二醇之间的转化 4 1.3.3 乙偶姻的代谢生理意义 4 1.4 谷氨酸棒状杆菌代谢特征 5 1.5 提高微生物合成乙偶姻的代谢工程策略 6 1.5.1 强化乙偶姻合成途径的相关基因 6 1.5.2 增加前体物丙酮酸的供给 6 1.5.3 降低乙偶姻的消耗 7 1.6 本文选题背景和主要研究内容 7 1.6.1 选题背景 7 1.6.2 本课题主要研究内容和研究意义 8 第二章 实验材料和方法 10 2.1 实验材料 10 2.1.1 菌种和质粒 10 2.1.2 主要实验仪器 12 2.1.3 实验药品 13 2.1.4 主要溶液配置 15 2.1.5 培养基 16 2.2 实验方法 17 2.2.1 菌株培养和发酵 17 2.2.2 CaCl2 法-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 17 2.2.3 谷氨酸棒状杆菌感受态的制备和转化 18 2.2.4 大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌质粒的提取 19 HYPERLINK \l _TOC_250009 2.2.5 基因组 DNA 提取 20 HYPERLINK \l _TOC_250008 2.2.6 DNA 片段回收纯化 20 HYPERLINK \l _TOC_250007 2.2.7 PCR 反应体系 21 HYPERLINK \l _TOC_250006 2.2.8 重组 PCR 反应体系 22 HYPERLINK \l _TOC_250005 2.2.9 DNA 片段切胶回收 23 2.2.10 酶切体系 24 HYPERLINK \l _TOC_250004 2.2.11 DNA 片段连接 24 2.2.12 琼脂糖凝胶电泳 25 2.2.13 目的基因敲除方法 25 2.2.14 菌落（菌液）PCR 28 2.2.15 细胞内蛋白含量测定 29 2.2.16 ALS 酶活测定 29 2.2.17 引物设计和基因测序 30 第三章 实验结果与讨论 31 C. glutamicum ATCC 13032 代谢工程改造 32 3.1.1 乙偶姻合成支路 alsSD 操纵子的表达 32 aceE 基因敲除 35 ldhA 基因敲除 39 pqo 基因敲除 42 butA 基因敲除 45 3.2 工程菌株基本培养基发酵 48 3.2.1 CGL1 发酵结果 48 HYPERLINK \l _TOC_250003 3.2.2 菌株 CGL2 发酵特征 49 HYPERLINK \l _TOC_250002 3.2.3 菌株 CGL3 发酵特征 51 HYPERLINK \l _TOC_250001 3.2.4 菌株 CGL4 发酵特征 52 HYPERLINK \l _TOC