分化抑制蛋白ID和HIV-1整合酶抑制剂的结构分子生物学研究病理学与病理生理学专业论文.docx

军医进修学院博士学位论文 军医进修学院博士学位论文 PAGE PAGE 5 分化抑制蛋白 ID 和 HIV-1 整合酶抑制剂的结构 分子生物学研究 中文摘要 第一部分 目的：分化抑制蛋白（Id）家族在细胞增殖、分化、以及肿瘤发生进展 过程中均有重要作用。本研究对该家族蛋白的 N 端序列进行保守性结构分析 并构建其基因突变体。 方法：应用 ClustalX(1.81)软件对 Id 蛋白家族中三个成员（Id1-3）的 N 端 序列进行同源性分析；Swiss-PdbViewer3.7(SP5)软件模拟高同源区域中关键性 氨基酸突变前后的三维结构模型；以 PCR 方法将突变点引入 Id 序列，通过 重叠 PCR 方法扩增出全长编码序列；酶切与测序确证突变序列的准确性。 结果：Id1-3 蛋白的 N 端存在一个由 11 个氨基酸形成的高度保守的旋转- 螺旋（Loop-Helix）结构，将其中最保守的丝氨酸与亮氨酸分别突变为甘氨酸 与缬氨酸；成功构建包含突变 Id 基因序列的 pGEX 原核表达载体。 结论：本研究在 Id1-3 蛋白 N 端识别了一个保守的 Loop-Helix 结构，为 深入研究其协同的功能特征提供了结构依据；构建的突变其中的丝氨酸表达 载体为研究 Id 蛋白磷酸化修饰和功能奠定基础。 第二部分 目的：儿茶素家族化合物作为一种毒副作用小、价格低廉的天然化合物， 已显示出对艾滋病毒的抑制效果，但其抑制机理仍不明确。本研究探讨儿茶 素家族化合物对于 HIV-1 整合酶的抑制效果，初步阐明该家族化合物对艾滋 病毒的抑制机理。 方法：采用 ELISA 实验方法检测四种带有没食子酰基的儿茶素对于 HIV-1 整合酶的抑制力。将这四种儿茶素按照等比例混合，检测它们协同抑制的效 果，同时选择一种无没食子酰基的儿茶素 EC 作为对照。采用分子对接的计算 机模拟方法研究没食子酰基的儿茶素对于 HIV-1 整合酶的抑制机理。 结果：通过 ELISA 实验方法，发现四种含有没食子酰基的儿茶素，包括 Catechin gallate ( CG)，表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG），Gallocatechin gallate (GCG)，和表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate, ECG）对 HIV-1 整合酶有显著的抑制效果。通过分子对接的研究发现，当 HIV-1 整合酶没有结合病毒 DNA 的时候，这四种儿茶素会结合在 T yr143 和 Gln148 氨基酸上，因此改变了整合酶环状结构（Gly140-Gly149）的柔韧性，从而降 低了整合酶的活性。此外，当整合酶与病毒 DNA 结合上之后，这四种儿茶素 可以结合在整合酶与病毒 DNA 之间，从而干扰其整合效率。并且，这四种儿 茶素具有很高的协同抑制效果，通过 ELISA 实验方法测定的四种药物的混合 物对整合酶的半数抑制浓度（IC50=0.1μmol/L）优于已用于临床的整合酶抑制 剂 raltegravir。 结论：发现四种含没食子酰基(CG、EGCG、GCG，ECG)的儿茶素对 HIV-1 整合酶有显著的抑制效果, 其作用机制为儿茶素结合在 Tyr143 和 Gln148 氨基 酸上，改变整合酶环状结构（Gly140-Gly149）的柔韧性，从而降低整合酶的 活性。四种儿茶素具有很高的协同抑制效果，其混合物对整合酶的半数抑制 浓度为（IC50=0.1μmol/L ），表明含没食子酰基的儿茶素有望成为一种新的 HIV-1 整合酶抑制剂。 关键词：结构分子生物学；分子对接；HIV-1 整合酶；分化抑制蛋白；表达载 体 军医进修学院博士学位论文 军医进修学院博士学位论文 PAGE PAGE 7 Structure molecular biology research on inhibitor of differentiation proteins and HIV-1 integrase inhibitors Abstract The first research work: Objectives: Id proteins are importance of regulating cell growth and differentiation, associated with the progression of tumor. The purpose of this study is to analyze N-terminal domain in Id1-3 proteins, look for functional sites and build up prokaryotic expression ve