代谢物轮廓分析提高筑波链霉菌FK506产量-生物化工专业论文.docx

decreased by 31% and 39%, respectively, compared with the values of control. This novel method developed by us provided a new way to impove the low-titer biomass products. KEYWORDS: FK506, Streptomyces tsukubaensis, metabolic profiling, rational feeding strategies 目 录 第一章 文献综述 1 HYPERLINK \l _TOC_250008 1.1 FK506 概述 1 HYPERLINK \l _TOC_250007 1.1.1 FK506 的发现 1 HYPERLINK \l _TOC_250006 1.1.2 FK506 的理化性质 1 HYPERLINK \l _TOC_250005 1.1.3 FK506 的生物合成途径 1 HYPERLINK \l _TOC_250004 1.1.4 FK506 的免疫抑制作用机制与器官移植市场 3 HYPERLINK \l _TOC_250003 1.1.5 发酵法在 FK506 生产的应用现状 5 HYPERLINK \l _TOC_250002 1.1.6 代谢工程在 FK506 生产的应用现状 6 HYPERLINK \l _TOC_250001 1.1.7 分子生物学在 FK506 合成的研究现状 8 HYPERLINK \l _TOC_250000 1.2 FK506 产量提高的主要瓶颈 10 1.3 基于质谱的代谢组学及其主要应用 12 1.3.1 代谢组学的研究策略 13 1.3.2 代谢组学解析微生物生理特征方面研究进展 21 1.4 本课题的研究意义和研究内容 22 第二章 实验材料与方法 25 2.1 实验材料 25 2.1.1 菌种 25 2.1.2 实验药品 25 2.1.3 实验仪器 26 2.1.4 主要试剂 27 2.1.5 培养基和培养方法 27 2.2 出发菌株筛选方法 28 2.3 培养基的动态检测 30 2.3.1 总糖的动态检测方法 30 2.3.2 总氮的动态检测方法 31 2.3.3 溶氧的动态检测方法 31 2.3.4 有机酸的动态检测方法 32 2.3.5 生物量的动态检测方法 32 2.3.6 pH 值的动态检测方法 32 2.3.7 FK506、FK520 和 FK506D 的动态检测方法 33 2.4 代谢轮廓学实验方法 34 2.4.1 胞内代谢物的淬灭 34 2.4.2 胞内代谢物的提取 34 2.4.3 样品的衍生化 35 2.4.4 GC-MS 检测代谢物 35 2.4.5 个别代谢物的 LC-MS 检测方法 37 2.4.6 代谢物分析及数据处理 38 2.5 前体的理性添加强化 38 2.5.1 中心碳代谢前体添加方法 38 2.5.2 莽草酸途径、氨基酸途径、哌可酸途径前体添加方法 39 2.5.3 脂肪酸途径前体添加方法 39 2.6 实验的准确性设计 39 第三章 FK506 合成的关键代谢物和关键途径确定 40 3.1 基于培养基动态检测揭示关键代谢物的理论分析 40 3.2 高产培养基(M2)与地产培养基(M1)发酵过程比较解析 40 3.3 培养基成分动态检测无法揭示关键因素的原因分析 42 3.4 代谢组学的必要性分析 42 3.5 利用代谢轮廓学确定胞内关键代谢物和代谢途径 43 3.5.1 筑波链霉菌发酵 FK506 过程中胞内代谢物的分析 43 3.5.2 多元统计分析筑波链霉菌胞内代谢差异 47 3.6 筑波链霉菌关键代谢物和代谢途径的不足性分析 53 3.6.1 中心碳代谢途径（EMP、PPP 和 TCA） 53 3.6.2 莽草酸途径 54 3.6.3 氨基酸代谢 56 3.6.4 脂肪酸代谢 57 3.7 本章小结 58 第四章 代谢轮廓分析指导下的理性强化 59 4.1 M2 发酵特性理性强化 59 4.1.1 中心碳代谢途径（EMP、PPP、TCA）理性强化 60 4.1.2 莽草酸代谢途径理性强化 60 4.1.3 氨基酸代谢途径理性强化 61 4.1.4 脂肪酸代谢途径理性强化 61 4.2 组合优化培养基 M3 发酵产物监测和强化效果验证 62 4.3 本章小结 64 第五章 结论与展望 65 5.1 本文结论