法夫酵母胞内6G-呋喃果糖苷酶的分离纯化及性质研究-制糖工程专业论文.docx

摘 要 法夫酵母胞内 6G-呋喃果糖苷酶的分离纯化及性质研究 学科、专业：制糖工程 硕士研究生姓名：陈静 指导教师：金征宇教授 法夫酵母胞内 6G-呋喃果糖苷酶，在以高浓度蔗糖为底物时，能够生产新科斯糖作 为主要转糖基产物。新科斯糖(neokestose)是一种蔗果三糖族低聚糖，由果糖基 C-2 与蔗 糖分子中的葡萄糖基 C-6 位相连所得，与其他低聚果糖相比具有更好的益生菌功能和稳 定的化学特性。 论文以法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous 269）为出发菌株，摇瓶发酵收集 菌体后，对法夫酵母的破壁方法进行了研究。结果表明：高压细胞破碎方法的破壁率为 89.8%，高压均质方法的破壁率达到 87.5%，均明显优于冻融法的 50.1%。然而，高压均 质法破壁率虽然较高，但是不能进行温度控制，使得酶活性受到影响；而采用高压细胞 破碎仪进行破碎, 蛋白质的含量较高，酶的活力也大大高于其他的破碎方法。 本文对胞内 6G-呋喃果糖苷酶的分离纯化也进行了研究。粗酶液经聚乙二醇（PEG） 20000 浓缩后，上 DEAE 纤维素 52 阴离子交换柱两次层析得到电泳纯的酶蛋白，总酶 活回收率为 13.4%，比酶活为 238.64 U/mg，比粗酶液提高了 35 倍。经 SDS分析， 胞内 6G-呋喃果糖苷酶的分子量约为 33 kDa。 纯化后的胞内 6G-呋喃果糖苷酶的酶学性质研究表明，胞内 6G-呋喃果糖苷酶的最适 温度为 45℃，最适 pH 为 6.4；在 pH4.0～7.0 的范围内和小于 45℃时具有较好的稳定性。 Ca2+，Li+，Mn2+，Ba2+ 和 Al3+对酶具有 1.25?1.4 倍的激活作用，Zn2+对酶活性有较小 的抑制作用，而 K+和 Mg2+则没有显著的影响。EDTA 对酶活力有显著的激活作用，而 SDS 则具有明显的抑制作用，残余酶活仅为 65%。对于胞内 6G-呋喃果糖苷酶的转移活 性，米氏常数 Km 和最大反应速率 Vmax 分别为 511 mmol/l、233 μmol/(min·mg)；水解 活性的 Km，Vmax 值分别是 62 mmol/l 和 164 μmol/(min·mg)，其底物抑制的解离常数 877 mmol/l。在 40%蔗糖作为底物时，最大 neo-FOS 的产量为 73.9g/l。 工业化过程中生产低聚果糖一般采用粗酶液，为了更好的控制低聚果糖的工业化生 产，对法夫酵母胞内粗酶液的酶学性质进行了研究，结果显示：该酶最适 pH 为 6.4，最 适温度为 60℃；在温度小于 70℃，pH4.0～7.0 范围内，酶具有较好的稳定性。Zn2+和 Mg2+对酶活力有抑制作用，SDS 对酶的抑制作用最为显著，残余活力仅为 64.56%；Ba2+， Al3+对酶活性有较少促进作用。 关键词：胞内 6G-呋喃果糖苷酶，Xanthophyllomyces dendrorhous 269，酶学特性，新低 聚果糖 Abstract Using sucrose as the substrate, 6G-fructofuranosidases from Xanthophyllomyces dendrorhous produces neokestose as the main transglycosylation product, a potentially novel bifidogenic trisaccharide. Neokestose with β-2, 6 linkage between fructose and a glucosyl group (6G-FOSs) has better prebiotic properties and chemical stability compared to FOSs. In this paper, FOSs produced by X. dendrorhous 269 as the starting strain was studied. Three kinds of wall breaking methods were used to release the intracellular 6G-fructofuranosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous, the results indicated that the wall-broken rate on cell disruption system was 89.8%, 87.5% for high-pressure homogenizing system, which all significantly better th