《外植体》课件.ppt

一、外植体的种类 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 基因型 草本＞木本 双子叶植物＞单子叶植物 二、外植体的来源 1、生长健壮 在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。 原因：代谢旺盛 再生能力强（比较容易培养成功）。 2、不同部位 ：靠近植株的近基部比较易成功。 三、取材季节 组织培养选择材料时要注意: 植物的生长季节（生长最适季节） 植物的生长发育阶段。 如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。 四、选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。 材料太大:易污染，也不需要； 材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。 一般选取培养材料的大小，在0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。 四、选取适宜的大小 茎尖分生组织：1-2个叶原基，0.2-0.3mm 叶片、花瓣：5mm2 茎段：0.5cm 五、外植体的生理状态和发育年龄 沿植物主轴越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官，反之相反。 二、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进70%的酒精中约30s。 ②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡10min。 或用10%的漂白粉上清液中浸10min～ 15min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。 第三节　污染原因和预防措施 一、污染的原因 污染：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 污染的原因： 从病源菌方面来分析主要有： 细菌 真菌 从污染的途径而言主要是： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底、 操作人员未遵守操作规程等。 2．操作期间 在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮 盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。 4．工具用后及时消毒 工具用后及时消毒，避免交叉污染。 工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。 5．空气中有灰尘 由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。 第五节 外植体的褐变及其预防措施 一、褐变概念 二、褐变的原因 三、影响褐变的因素 四、褐变的预防措施 一、褐变概念 褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。 褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水， 第五节 外植体的培养条件 光照 温度 湿度 氧气 培养基的pH值等。 1．光照 通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。 分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。 普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx- 5000lx。 3．湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面： 一是培养容器内的湿度：它的湿度条件常可保证100%。 二是培养室的湿度：它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。 湿度过低：会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化。 湿度过高：会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。 小