大豆生物活性肽功能研究-Lunasin原核表达纯化及活性鉴定-生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘 要 大豆生物活性肽 Lunasin 是 1987 年日本的一个研究小组从大豆中分离鉴定的一 个天然多肽，全长 43 个氨基酸残基，分子量 5kDa。分子内含有一个细胞粘附序列 Arg-Gly-Asp (RGD)，此序列可与细胞外基质相连；Lunasin 的 C 末端含有 8 个天门 冬氨酸残基，此结构与多肽的抗有丝分裂效应相关，可以结合到去乙酰化的染色质 区（如，着丝粒），导致有丝分裂中止而最终引起细胞死亡。研究发现，Lunasin 具 有抑制结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的功能。该多肽具有抗炎作用，可以通过抑制 NF-κB 通路来抑制炎症进程。由于 Lunasin 具有特殊结构和功能，因此对 Lunasin 的 研究具有重要意义。 Lunasin 在天然原料中的含量很低，因此直接提取纯化程序复杂且成本高。所以 本研究以 Lunasin 的基因序列为依据，人工合成基因寡聚核苷酸序列，通过酶切、连 接将 Lunasin 基因克隆到原核表达载体 pET-32a(+)中，得到重组载体 pET-32a(+) -Lunasin-6His，然后将重组载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中。通过对诱导表达条件 的优化，发现工程菌在 30℃，0.05mM IPTG 诱导 4h 后可溶性表达。经过经 Sephrose －镍亲和层析柱纯化，并由 SDS和 Western Blot 鉴定表达产物为 6kDa 的带 六个组氨酸(6His)标签的融合蛋白。并利用巨噬细胞 RAW264.7 检验其生物活性。通 过原核表达的方法表达纯化 Lunasin 的优点是流程短、操作简单方便、成本较低、技 术成熟稳定。 本研究为 Lunasin 的结构功能研究打下了基础，对今后利用基因工程的方法生产 该蛋白并应用于临床具有一定的意义。 关键词 Lunasin；原核表达；载体构建；亲和层析；Western Blot；生物活性分析 Abstract Lunasin is a 43 amino acid residues polypeptide with a mass of 5kDa，characterd as a soybean bioactive peptide by a Japanese research team in the 1987. Lunasin contains the cell adhesion motif Arg-Gly-Asp(RGD), known to allow attachment to the extracellular matrix. It also contains 8 Asp residues in its carboxyl end that have been found to be responsible for its antimitotic effect, after their binding to regions of hypoacetylated chromatin (such as in centromeres), leading to mitotic arrest and eventually to cell death. It has been demonstrated that Lunasin can prevent colon cancer, breast cancer and prostate cancer. It can also inhibite inflammation by suppressing NF-κB pathway in LPS-induced RAW264.7 macrophage. For the interesting structure and function of Lunasin, it is very important for us to study the bioactive peptide Lunasin. Lunasin content is too low to purify from natural materials, purification is complicated and expensive. So the gene of Lunasin was artificially synthetic based on the amino-acid sequence of Lunasin. After enzyme hydrolysis, conjunction, the fragment was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+). The recombinant expression